BD, 560753, Kit de clasificación de células T reguladoras humanas BD Pharmingen™

Aplicación: Citometría de flujo, clasificación celular activada por fluorescencia (probado durante el desarrollo)
Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2869362
Descripción: Descripción El sistema inmunitario protege a los individuos de una amplia gama de microorganismos patógenos, evitando al mismo tiempo respuestas inmunitarias inapropiadas o extremas, como las respuestas inmunitarias autoinmunitarias o alérgicas que podrían ser dañinas. La inmunidad adaptativa está mediada en gran medida por las poblaciones de linfocitos T y B que pueden reconocer específicamente una constelación diversa de antígenos extraños. A través de procesos de rápida expansión clonal y diferenciación, los linfocitos estimulados por antígenos generan una amplia gama de potentes progenies de células efectoras y de memoria para eliminar con éxito del cuerpo el antígeno extraño ofensivo. Una clase distinta de células T, llamadas células T reguladoras (Treg), protege contra la capacidad de respuesta del sistema inmunitario a los antígenos propios y restringe la capacidad de respuesta excesiva a los antígenos extraños que podrían ser dañinos para el huésped. Las células T reguladoras CD4+ naturales (nTreg) se generan en el timo como una subpoblación funcionalmente madura de células T. Estas células emigran al grupo periférico de células T y expresan constitutivamente niveles de medios a altos de CD25 (cadena α del receptor de IL-2) y Foxp3 (caja P3 de forkhead). El factor de transcripción Foxp3 pertenece a la familia de factores de transcripción forkhead/winged-helix y es un regulador clave del desarrollo y la función de las células Treg. CD127 (cadena α del receptor de IL-7) constituye otro marcador útil de la superficie celular para identificar células Treg. CD127 se regula a la baja en las células Treg, lo que se correlaciona inversamente con la expresión de Foxp3. Las células reguladoras T CD4+ inducibles (iTreg) pueden surgir de células T CD4+ periféricas maduras vírgenes que no expresan CD25 ni Foxp3 (células CD4+CD25-Foxp3-). Estudios recientes indican que los linfocitos T CD4+FoxP3+ humanos naturales pueden subdividirse en subgrupos fenotípica y funcionalmente distintos según los niveles de coexpresión de Foxp3, CD25 y CD45RA. El marcador CD45RA es especialmente útil para identificar linfocitos Treg CD4+ naturales en reposo (CD45RA+), así como linfocitos Treg CD4+ activados in vivo (CD45RA-) cuando se utiliza con los marcadores Foxp3, CD25 y CD127. Los estudios fenotípicos y funcionales que utilizan estos marcadores proporcionan la base para análisis de alta resolución de la dinámica de la generación y diferenciación de linfocitos Treg en el desarrollo, la edad y las enfermedades. El kit de clasificación de linfocitos T reguladores humanos BD™ proporciona reactivos que permiten a los investigadores teñir células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas viables o una fracción enriquecida de linfocitos T CD4+ de PBMC, y purificar células CD4+CD25+CD127lo (opcionalmente CD45RA+). Estas células pueden analizarse funcionalmente o usarse como precursoras en cultivos de expansión y diferenciación para generar células Treg activadas. Otras fracciones celulares, como las células CD4+CD25-CD127+ (células T CD4+ vírgenes), pueden purificarse simultáneamente mediante citometría de flujo para su posterior caracterización funcional. Además, se incluye un anticuerpo fluorescente anti-CD45RA humano para facilitar la caracterización o clasificación de linfocitos T CD4+Foxp3+ o CD4+Foxp3- vírgenes (CD45RA+) o activados/de memoria (CD45RA-).
Preparación y almacenamiento: Preparación y almacenamiento Almacenar sin diluir a 4 °C y protegido de la exposición prolongada a la luz. No congelar. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo de tejidos o ascitis por cromatografía de afinidad. El anticuerpo se conjugó con PerCP-Cy5.5 en condiciones óptimas, y se eliminaron el anticuerpo no conjugado y el PerCP-Cy5.5 libre. No se recomienda el almacenamiento de conjugados de PerCP-Cy5.5 en diluyentes no optimizados, ya que puede resultar en la pérdida de intensidad de la señal. El anticuerpo se conjugó con el colorante en condiciones óptimas y se eliminaron el anticuerpo no conjugado y el colorante libre. El anticuerpo se conjugó con el colorante en condiciones óptimas y se eliminó el colorante sin reaccionar.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Aislar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) Preparar PBMC mediante centrifugación en gradiente de densidad. Tinción de anticuerpos para clasificación celular El siguiente procedimiento describe cómo teñir los controles y la muestra de células para la clasificación. El kit no requiere el uso de controles de isotipo para realizar una clasificación exitosa. Cada población ha sido bien caracterizada y verificada para patrones de tinción. Sin embargo, puede que desee utilizar sus propios controles de isotipo de fluorescencia menos uno (FMO) según lo desee. Nota: Siga los procedimientos de tinción y clasificación asépticos si planea expandir la población de Treg aislada. 1. Etiquete cinco tubos de 12 × 75 mm para compensación. Siga las instrucciones del juego de partículas de compensación de control negativo (FBS) κ/anti-Ig de ratón n.º de cat. 552843. Prepare las perlas para citometría de flujo según el procedimiento de ensayo recomendado. Tubo 1: Perlas de compensación sin teñir Tubo 2: Perlas de compensación FITC Tubo 3: Perlas de compensación PE Tubo 4: Perlas de compensación PerCP-Cy5.5 Tubo 5: Perlas de compensación AlexaFluor® 647 Tubo 6: Opcional: Tubo de compensación Horizon V450 para tinción FoxP3 posterior a la clasificación 2. Agregue los siguientes anticuerpos de los viales individuales contenidos en el kit a los tubos etiquetados en el paso n.º 1. -Tubo de compensación FITC: 20 µl de CD45RA FITC -Tubo de compensación PE: 20 µl de CD25 PE -Tubo de compensación PerCP-Cy5.5: 20 µl de CD4 PerCP-Cy5.5 -Tubo de compensación AlexaFluor® 647: 20 µl de CD127 APC Prepare las perlas para citometría de flujo como se describe en las instrucciones para el cat. N.° 552843, Juego de Partículas de Compensación de Ig Antirratón, κ/Control Negativo (FBS). 3. Tinción de la Muestra: Separar la muestra que se va a clasificar en un tubo de 50 ml para la tinción de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o células CD4+ enriquecidas. Para un número total de PBMC inferior a 100 millones, la concentración de tinción es de 20 millones por 1,0 ml. Para un número total de PBMC superior a 100 millones, la concentración de tinción es de 100 millones por 1,0 ml. Nota: El tamaño de la muestra es de 200 µl por 100 millones de células. El tampón de lavado es 1x PBS + 1 % de suero AB humano. 4. Añadir el anticuerpo: 200 µl de Cocktail y 200 µl de CD45RA por 100 millones de células. Por ejemplo: -120 millones de células, añadir 240 µl de Cocktail y CD45RA a un volumen final de 1,2 ml - 50 millones de células, añadir 100 µl de Cocktail y CD45RA a un volumen final de 2,5 ml 5. Incubar protegido de la luz a 18 °C - 22 °C durante 30 min. 6. Añadir suficiente tampón de lavado (p. ej., 49 ml) para llenar un tubo de 50 ml y centrifugar a 250 xg durante 15 min. 7. Aspirar el sobrenadante y resuspender la muestra a una concentración de 5 - 10 millones de células/ml en tampón de lavado. 8. Preparar los tubos de recepción. Cubra 12 tubos de polipropileno de 75 mm con 0,2 ml de suero AB humano, invierta y añada 0,2 ml de medio [(formulación; X-VIVO-15 (Cambrex) + 10 % de suero AB humano (Sigma) + solución de acetilcisteína al 0,2 %)] o utilice tampón de lavado PBS. 9. Utilice el clasificador de células FACSAria™ para aislar las poblaciones celulares de interés. Opciones de población para la clasificación: Población central Células CD4+/CD25int-hi/CD127lo CD4+/CD25int-hi/CD127lo/CD45RA+ Células CD4+/CD25int-hi/CD127lo/CD45RA- Células CD4+/CD25-/CD127lo CD4+/CD25-/CD127lo/CD45RA+, células CD4+/CD25-/CD127lo/CD45RA-. 10. Recoja las fracciones en 12 tubos de polipropileno de 75 mm recubiertos con suero AB humano y que contengan medio. 11. Centrifugue las fracciones a 250 xg durante 10 minutos y retire el sobrenadante sin alterar el sedimento. Resuspenda en tampón de lavado y recupere al menos 30 000 células para la tinción con FoxP3 o las adquisiciones posteriores a la clasificación, o al menos 50 000 células para la expansión. Nota: Asegúrese de utilizar 1x PBS + 1 % de suero AB humano al adquirir las fracciones posteriores a la clasificación. 12. Proceda con el protocolo de tinción con FoxP3 modificado (a continuación), la expansión, la supresión u otro protocolo posterior de su elección. Protocolo de clasificación. Se puede utilizar una boquilla de 70 o 100 micras para este procedimiento. Una boquilla de 70 micras permitirá caudales y presiones suficientes para clasificar aproximadamente 100 millones de PBMC en 0,5-2,5 horas y obtener aproximadamente 90 000 células T reguladoras CD45RA+, según el donante. Una boquilla de 100 micras puede permitir mayores purezas y viabilidades, duplicando aproximadamente el tiempo de clasificación. Puede requerirse la clasificación de 200 millones de células o más para una recuperación adecuada de células T CD25bright CD45RA-. Consulte la figura y su leyenda para obtener las directrices completas de selección. Protocolo de tinción posterior a la clasificación de FoxP3. El siguiente procedimiento describe un protocolo modificado de tinción de FoxP3 para las fracciones posteriores a la clasificación. Manipule las células mínimamente y evite fuerzas g elevadas después de la clasificación. Una clasificación exitosa de 100-250 millones de PBMC proporcionará suficientes células para evaluar la viabilidad y la expresión de FoxP3 en un experimento de verificación y probablemente suficientes para la expansión. Sin embargo, recomendamos conservar las fracciones de CD45RA para las mediciones de pureza y teñir las células para FoxP3 cuando haya abundantes células más adelante en la expansión. Recomendamos la tinción en tubos o placas pequeños de polipropileno. No es necesaria la tinción superficial si las fracciones posteriores a la clasificación se fijan y analizan el mismo día de la clasificación, pero este procedimiento reducirá la relación señal-ruido de la fluorescencia FITC. Como alternativa, se pueden teñir las células expandidas con CD3 (n.° de cat. 555333) y/o CD4 (n.° de cat. 565999), cóctel de células T reguladoras humanas (n.° de cat. 560249) o con 10 µl de este kit por prueba. 1. Calentar los tampones a temperatura ambiente antes de su uso. Prepare soluciones de trabajo del juego de tampones BD Pharmingen Human FoxP3 (n.º de cat. 560098) y siga este protocolo modificado: 2. Etiquete cinco tubos de microcentrífuga de polipropileno de 0,65 ml (VWR MN 87003-290) Tubo 1: Fracción de preclasificación Tubo 2: CD4+CD25++CD127lowCD45RA- Control de isotipo Horizon V450 (n.º de cat. 560373) Tubo 3: CD4+CD25++CD127lowCD45RA- Horizon V450 FoxP3 (n.º de cat. 560460) Tubo 4: CD4+CD25++CD127lowCD45RA+ Control de isotipo Horizon V450 Tubo 5: CD4+CD25++CD127lowCD45RA+ Horizon V450 FoxP3 3. Prepare fracciones humanas clasificadas para la tinción con FoxP3. 4. Centrifugue los tubos receptores después de la clasificación a 250 xg durante 10 minutos, retire con cuidado el tampón de lavado. 5. Diluya las células a al menos 30 000 células por 50 µl en tampón de tinción BD Pharmingen (FBS).* Nota: utilice 200 000 células para el tubo 1 para ayudar a ajustar FSC y SSC al adquirir células fijadas. 6. Añada 500 µl de tampón de tinción BD Pharmingen (FBS). Centrifugue a 250 xg durante 5 minutos, retire con cuidado el tampón de lavado. 7. Para fijar las células, añada 250 µl de tampón A 1x por tubo, agite con vórtex suavemente durante un segundo, incube durante 10 minutos a temperatura ambiente protegido de la luz. Nota: Paso opcional, almacene durante la noche a 4 °C y continúe el procedimiento al día siguiente. Lleve a temperatura ambiente antes del paso 8. 8. Centrifugue a 250 xg durante 5 minutos y retire el fijador. Precaución: Tenga en cuenta que el pellet es flotante. 9. Para permeabilizar las células, resuspenda suavemente el pellet en el tampón de fijación de volumen residual y luego agregue 250 µl de una solución de trabajo 1x de tampón C Human FoxP3 a cada tubo. Agite suavemente en vórtex durante un segundo, incube durante 30 minutos a temperatura ambiente protegido de la luz. 10. Agregue 500 µl de tampón de tinción BD Pharmingen (FBS). Centrifugue a 250 xg durante 5 minutos, retire con cuidado el tampón de lavado dejando ~50 µl de tampón residual. 11. Agregue el anticuerpo FoxP3 conjugado con V450 y/o el control de isotipo a 0,5x del tamaño de prueba indicado en el vial. Agite suavemente en vórtex durante un segundo. 12. Incube durante 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. 13. Repita el paso de lavado n.º 9. 14. Resuspenda en 300 µl de PBS 1x y analice inmediatamente. Adquiera de 500 a 2000 eventos de células CD4 positivas para obtener mejores resultados. Nota: Optimice la configuración de FSC frente a SSC con la fracción de preclasificación. El arrastre de un tubo a otro puede afectar la interpretación de los datos recopilados en fracciones muy pequeñas de células. Se recomienda adquirir un tubo de PBS entre análisis para definir el fondo o el arrastre de tubos anteriores. * Recomendamos utilizar el tampón de tinción BD Pharmingen (FBS; n.° de cat. 554656) para la tinción inicial de la superficie y todos los pasos de lavado, y cubrir los tubos con tapas o parafilm durante los pasos de incubación. También recomendamos optimizar los voltajes de dispersión frontal y lateral para visualizar los linfocitos separados de los residuos o las plaquetas antes de la adquisición. Las BD® CompBeads pueden utilizarse como sustitutos para evaluar el derrame de fluorescencia (compensación). Cuando los anticuerpos conjugados con fluorocromos se unen a las BD® CompBeads, presentan propiedades espectrales muy similares a las de las células. Sin embargo, para algunos fluorocromos, puede haber pequeñas diferencias en las emisiones espectrales en comparación con las células, lo que resulta en valores de derrame que difieren de los controles biológicos. Se recomienda encarecidamente que, al utilizar un reactivo por primera vez, se compare el derrame en la célula y en las BD® CompBeads para asegurarse de que estas últimas sean adecuadas para su aplicación celular específica.
Avisos del producto: Avisos del producto Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para conocer los protocolos técnicos. La emisión del fluorocromo Alexa Fluor® 647 se recopila con la misma configuración del instrumento que para la aloficocianina (APC). La fuente de todas las proteínas séricas proviene de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en los Estados Unidos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Los anticuerpos marcados con PerCP-Cy5.5 se pueden usar con reactivos marcados con FITC y R-PE en citómetros de flujo de láser único sin superposición espectral significativa de la fluorescencia de PerCP-Cy5.5, FITC y R-PE. PerCP-Cy5.5 está optimizado para usarse con un solo láser de iones de argón que emite luz de 488 nm. Debido al amplio espectro de absorción del fluorocromo en tándem, se debe tener especial cuidado al utilizar citómetros de doble láser, ya que pueden excitar directamente tanto el PerCP como el Cy5.5™. Recomendamos el uso de compensación de haz cruzado durante la adquisición de datos o compensación de software durante el análisis de datos. Para obtener información sobre los espectros de fluorocromo y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web sobre citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. Se debe utilizar un control de isotipo a la misma concentración que el anticuerpo de interés. Este producto se proporciona bajo una licencia de propiedad intelectual entre Life Technologies Corporation y BD Businesses. La compra de este producto otorga al comprador el derecho intransferible de utilizar la cantidad adquirida del producto y sus componentes en las investigaciones que realice (ya sea una entidad académica o con fines de lucro). El comprador no puede vender ni transferir de otro modo (a) este producto (b) sus componentes ni (c) materiales fabricados con este producto o sus componentes a un tercero, ni utilizar de otro modo este producto, sus componentes ni los materiales fabricados con este producto o sus componentes para fines comerciales. Por fines comerciales se entiende cualquier actividad realizada por una parte a cambio de una contraprestación, que puede incluir, entre otras: (1) el uso del producto o sus componentes en la fabricación; (2) el uso del producto o sus componentes para proporcionar un servicio, información o datos; (3) el uso del producto o sus componentes con fines terapéuticos, diagnósticos o profilácticos; ni (4) la reventa del producto o sus componentes, independientemente de que dicho producto o sus componentes se revendan o no para su uso en investigación. Para obtener información sobre la compra de una licencia de este producto para cualquier otro uso, póngase en contacto con Life Technologies Corporation, Cell Analysis Business Unit Business Development, 29851 Willow Creek Road, Eugene, OR 97402, EE. UU., Tel.: (541) 465-8300. Fax: (541) 335-0504. Cy es una marca registrada de GE Healthcare. Consulte http://regdocs.bd.com para acceder a las fichas de datos de seguridad (FDS). Alexa Fluor™ es una marca registrada de Life Technologies Corporation. Cy es una marca registrada de Global Life Sciences Solutions Germany GmbH o una filial que opera bajo el nombre comercial de Cytiva. Tenga en cuenta las siguientes precauciones: Recomendamos tomar precauciones especiales (como envolver los viales, tubos o gradillas en papel de aluminio) para proteger los reactivos conjugados, incluidas las células teñidas con dichos reactivos, de la exposición a la iluminación ambiental. La absorción de luz visible puede afectar significativamente los espectros de emisión y el rendimiento cuántico de los conjugados de fluorocromos en tándem.
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