BD, 560758, Kit de fenotipado Th1/Th2/Th17 de ratón BD Pharmingen™

Aplicación: Citometría de flujo (probada durante el desarrollo)
Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2869363
Descripción: Descripción Componentes: 51-9006631 Cóctel de fenotipado Th1/Th2/Th17 de ratón 1,0 ml Contiene lo siguiente: CD4 PerCP-Cy5.5 de ratón (clon: RM4-5) IL-17A PE de ratón (clon: TC11-18H10.1) IFN-GMA FITC de ratón (clon: XMG1.2) IL-4 APC de ratón (clon: 11B11) 51-9006613 Tampón de fijación BD Cytofix™ 100 ml 51-2091KE Tampón BD Perm/Wash™ 25 ml 51-2092KZ Inhibidor del transporte de proteínas BD GolgiStop™ (que contiene monensina) 0,7 ml El grupo de células T CD4+ periféricas incluye múltiples subconjuntos de células T efectoras y de memoria que surgen a través de la expansión y diferenciación impulsadas por antígenos de Linfocitos T vírgenes. La respuesta temprana de los linfocitos T CD4+ vírgenes a la estimulación antigénica se caracteriza por una proliferación elevada y un repertorio limitado de citocinas. Una mayor diferenciación produce células con un potencial más diverso para la expresión de citocinas. Dependiendo del equilibrio de citocinas locales, moléculas coestimulantes, niveles de antígenos y factores genéticos, las respuestas inmunitarias generan células T auxiliares de tipo 1 (Th1), Th2 y Th17, efectoras y/o de memoria. Se han identificado subgrupos de linfocitos T CD4+ funcionalmente polarizados en función de sus patrones distintivos de secreción de citocinas. Como citocina característica, los linfocitos Th1 producen selectivamente grandes cantidades de interferón gamma (IFN-γ). Los linfocitos Th2 producen selectivamente IL-4, y los Th17 expresan altos niveles de IL-17A. A través de la secreción de IFN-γ y otras moléculas efectoras, las células Th1 activan macrófagos, células asesinas naturales (NK) y células T CD8+ y son responsables de la inmunidad celular. Las células Th1 proporcionan protección contra bacterias intracelulares, hongos, protozoos y virus y están involucradas en algunas respuestas autoinmunes. La IL-4 producida por las células Th2 es particularmente fuerte en impulsar a las células B para generar células secretoras de IgE. La IgE desempeña un papel en las reacciones inmunes mediadas por basófilos/mastocitos. Las células Th2 median la protección contra parásitos extracelulares pero también pueden causar el desarrollo de una respuesta alérgica dañina. A través de la secreción de IL-17A y otros factores, las células Th17 reclutan y activan neutrófilos y median respuestas inmunes contra bacterias y hongos extracelulares. Las células Th17 también están implicadas en respuestas autoinmunes. Además de estos tipos de linfocitos T cooperadores, se han descrito células Th0 (IL-4 e IFN-γ) y similares a Th17/Th1 (IL-17A/IFN-γ) que coexpresan citocinas distintivas. El paradigma Th1/Th2/Th17 proporciona un sistema modelo útil para investigar los mecanismos celulares y moleculares que median las respuestas inmunitarias protectoras y dañinas. El kit de fenotipado BD Mouse Th1/Th2/Th17 proporciona una combinación fácil de usar de cuatro colores de anticuerpos fluorescentes específicos para CD4 de ratón, IFN-γ (para Th1), IL-4 (para Th2) e IL-17A (para Th17) que permitirá a los investigadores identificar y caracterizar la naturaleza de estos tipos de linfocitos T cooperadores mediante análisis de citometría de flujo multicolor. El kit puede utilizarse para analizar con éxito muestras de células linfoides ex vivo (p. ej., para los tipos de linfocitos T cooperadores generados in vivo) o para monitorizar la diferenciación de linfocitos T cooperadores en células cultivadas en diversos sistemas modelo experimentales. Los investigadores deben tener en cuenta que el color del inhibidor del transporte de proteínas BD GolgiStop™ puede variar de transparente (incoloro) a amarillo claro.
Preparación y almacenamiento: Preparación y almacenamiento Almacenar sin diluir a 4 °C y protegido de la exposición prolongada a la luz. No congelar. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante del cultivo de tejidos o ascitis por cromatografía de afinidad. El anticuerpo se conjugó con FITC en condiciones óptimas y se eliminó el FITC que no reaccionó. El anticuerpo se conjugó con R-PE en condiciones óptimas y se eliminaron el anticuerpo no conjugado y el PE libre. El anticuerpo se conjugó con APC en condiciones óptimas y se eliminaron el anticuerpo no conjugado y el APC libre. El anticuerpo se conjugó con PerCP-Cy5.5 en condiciones óptimas y se eliminaron el anticuerpo no conjugado y el PerCP-Cy5.5 libre. No se recomienda el almacenamiento de conjugados de PerCP-Cy5.5 en diluyente no optimizado, ya que puede provocar la pérdida de intensidad de la señal.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados A. Estimulación de las células Se han descrito diversos métodos in vitro para la polarización o estimulación de subconjuntos de células T auxiliares, de los cuales PMA (éster de forbol) más ionomicina (ionóforo de calcio) ha sido particularmente útil para inducir y caracterizar rápidamente células policlonales productoras de citocinas. Para este kit, recomendamos la estimulación de células de bazo de ratón a una concentración de 1-10 millones de células por ml en medio durante 5 horas con PMA/ionomicina (a 50 ng/ml y 1 μg/ml respectivamente) en presencia del inhibidor del transporte de proteínas BD GolgiStop™ (incluido en el kit o n.º de cat. 554724). Añada 4 μl de BD GolgiStop™ por cada 6 ml de cultivo celular y mezcle bien. Se recomienda no mantener BD GolgiStop™ en cultivo celular durante más de 12 horas. Nota: Se deben realizar estudios cinéticos para determinar el tiempo de incubación óptimo para cada sistema experimental. Dependiendo del ratón, las frecuencias de células productoras de citocinas derivadas de la activación de células de bazo de ratón pueden variar ampliamente para una citocina específica. En particular, el número de células productoras de IL-17 puede ser muy bajo o incluso insignificante en células de bazo estimuladas con PMA/ionomicina. En estos casos, se deben considerar los cultivos de polarización Th17. Para obtener información específica sobre la polarización de las células Th17, consulte las referencias. B. Tinción de las células 1. Recolección de las células Recolecte células de cultivos estimuladores in vitro tratados con un inhibidor del transporte de proteínas. Centrifugue las células a 250 xg durante 10 minutos a temperatura ambiente (TA) y lave dos veces con tampón de tinción (FBS) (Cat# 554656). Cuente las células y transfiera aproximadamente 1 millón de células a cada tubo de ensayo de flujo (Cat# 352008) para tinción inmunofluorescente. Las células deben protegerse de la luz durante todo el procedimiento de tinción y el almacenamiento. 2. Fijación de las células a. Centrifugue las células a 250 xg durante 10 minutos a TA y suspenda completamente las células con 1 ml de tampón BD Cytofix™ frío (incluido en el kit o n.º de cat. 554655) e incube durante 10-20 minutos a TA. Nota: La agregación celular puede evitarse agitando con vórtex antes de añadir el fijador. b. Centrifugue las células a 250 xg durante 10 minutos a TA. Nota: Después de la fijación, el sedimento celular después de la centrifugación está suelto y se debe tener cuidado al aspirar el tampón de lavado de los tubos. No aspire TODO el tampón, pero deje 50-150 µl de solución en los tubos para evitar la pérdida de células en todos los pasos de lavado posteriores que se indican a continuación. c. Lave las células dos veces a TA en tampón de tinción (FBS) y centrifugue las células a 250 xg durante 10 minutos a TA. Nota: Las células se pueden almacenar en tampón de tinción a 4 °C durante un máximo de 72 horas o en 90 % FCS/10 % DMSO a -80 °C durante un máximo de seis meses (para muestras que se deban almacenar durante más de seis meses, recomendamos realizar estudios de estabilidad). 3. Permeabilización de las células fijadas a. Para células mantenidas a 4 °C, centrifugue las células a 250 xg durante 10 minutos a temperatura ambiente y retire el tampón de tinción. b. Para células almacenadas a -80 °C, descongélelas y lávelas dos veces con tampón de tinción (FBS) para eliminar el DMSO. c. Diluya tampón BD Perm/Wash™ 10x (incluido en el kit o n.º de cat. 554723) en agua destilada para preparar una solución 1x antes de usar. d. Suspenda las células en 1 ml de tampón BD Perm/Wash™ 1x e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos. e. Centrifugar las células a 250 xg durante 10 minutos a TA y retirar el sobrenadante. 4. Tinción con el cóctel a. Suspender completamente las células fijadas/permeabilizadas en cada tubo en 50 μl de tampón BD Perm/Wash™ y añadir 20 μl/tubo de cóctel o control negativo adecuado. Incubar a TA durante 30 minutos en la oscuridad. Las células deben protegerse de la luz durante todo el procedimiento de tinción. b. Opcional: Tinción de antígenos de superficie celular adicionales Nota: Si el instrumento lo permite, en este momento se puede realizar una tinción multicolor opcional de diferentes antígenos de superficie celular. Ejemplo: APC-Cy™7 CD3 (clon 145-2C11, n.º de cat. 557596) y V450 CD44 (clonIM7, n.º de cat. 560451), etc. Para la tinción de la superficie celular tras la fijación/permeabilización, es necesario identificar clones de anticuerpos adecuados que reconozcan epítopos desnaturalizados. Nota: Para los anticuerpos que no reconocen marcadores de superficie celular fijados/desnaturalizados, se recomienda que la tinción se realice en células vivas ANTES de la fijación/permeabilización. c. Lave las células dos veces con 1 ml de tampón BD Perm/Wash™ 1× a TA y suspenda en tampón de tinción (FBS) antes del análisis de citometría de flujo. C. Análisis de citometría de flujo Establezca el voltaje y la compensación de PMT utilizando células no teñidas y marcadores de superficie celular apropiados o utilice perlas de compensación BD™ (n.º de cat. 552844) según el protocolo recomendado. Nota: Se ha informado que la expresión de CD4 en las células T disminuye después de la activación celular. Nota: Adquiera al menos de 20 000 a 30 000 linfocitos CD4 positivos. Dependiendo del donante, las frecuencias de células productoras de citocinas derivadas de la activación de PBMC humanas pueden variar ampliamente para una citocina en particular. Para realizar mediciones de frecuencia estadísticamente significativas, se deben adquirir tamaños de muestra suficientemente grandes durante el análisis de citometría de flujo. Los diagramas de puntos bivariados o los diagramas de contorno de probabilidad se pueden generar mediante el reanálisis de datos para mostrar las frecuencias y los patrones mediante los cuales las células individuales coexpresan ciertos niveles de antígeno de superficie celular y proteínas citocinas intracelulares. Advertencias y precauciones Peligro: El inhibidor del transporte de proteínas BD GolgiStop™ (componente 51-2092KZ) contiene 99,61 % de etanol (p/p) y 0,26 % de monensina, sal monosódica (p/p). Indicaciones de peligro: Líquido y vapores altamente inflamables. Provoca irritación ocular grave. Declaraciones de precaución: Mantener alejado del calor, chispas, llamas abiertas y superficies calientes. No fumar. Usar guantes/protección ocular. Usar ropa protectora. EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL (o el pelo): Quítese inmediatamente toda la ropa contaminada. Enjuague la piel con agua/dúchese. EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Enjuague cuidadosamente con agua durante varios minutos. Quítese las lentes de contacto, si lleva y resulta fácil. Siga enjuagando. Eliminar el contenido/el recipiente de acuerdo con las regulaciones locales/regionales/nacionales/internacionales. Peligro: El tampón de fijación BD Cytofix™ (componente 51-9006613) contiene 4,2% (p/p) de formaldehído. Indicaciones de peligro: Nocivo si se inhala. Provoca irritación cutánea. Provoca lesiones oculares graves. Puede provocar una reacción alérgica en la piel. Se sospecha que provoca defectos genéticos. Puede provocar cáncer. Vía de exposición: Inhalatorio. Puede causar irritación respiratoria. Consejos de precaución: Llevar ropa protectora/protección ocular. Llevar guantes de protección. No respirar la niebla/los vapores/el aerosol. EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Aclarar cuidadosamente con agua durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto, si lleva y resulta fácil. Seguir aclarando. En caso de irritación o sarpullido en la piel: Consultar a un médico.
Avisos del producto: Avisos del producto Tenga en cuenta las siguientes precauciones: La absorción de luz visible puede alterar significativamente la transferencia de energía que ocurre en cualquier conjugado de fluorocromo en tándem; por lo tanto, recomendamos tomar precauciones especiales (como envolver viales, tubos o gradillas en papel de aluminio) para evitar la exposición de los reactivos conjugados, incluidas las células teñidas con esos reactivos, a la iluminación ambiental. Cy es una marca registrada de Amersham Biosciences Limited. Este producto conjugado se vende bajo licencia de las siguientes patentes: Patentes de EE. UU. n.º 5.486.616; 5.569.587; 5.569.766; 5.627.027. La fuente de todas las proteínas séricas proviene de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Este producto conjugado con PerCP se vende bajo la licencia de la siguiente patente: Patente estadounidense n.º 4.876.190. Este reactivo conjugado con APC puede utilizarse en cualquier citómetro de flujo equipado con láser de colorante, HeNe o diodo rojo. Los anticuerpos marcados con PerCP-Cy5.5 pueden utilizarse con reactivos marcados con FITC y R-PE en citómetros de flujo de láser único, sin superposición espectral significativa de la fluorescencia de PerCP-Cy5.5, FITC y R-PE. PerCP-Cy5.5 está optimizado para su uso con un único láser de iones de argón que emite luz de 488 nm. Debido al amplio espectro de absorción del fluorocromo en tándem, se debe tener especial cuidado al utilizar citómetros de láser dual, ya que pueden excitar directamente tanto PerCP como Cy5.5™. Recomendamos el uso de compensación de haz cruzado durante la adquisición de datos o compensación de software durante el análisis de datos. Este producto está sujeto a los derechos de propiedad de Amersham Biosciences Corp. y la Universidad Carnegie Mellon, y se fabrica y vende bajo licencia de Amersham Biosciences Corp. Este producto tiene licencia de venta únicamente para investigación. No está autorizado para ningún otro uso. Si necesita una licencia comercial para usar este producto y no la tiene, devuelva este material sin abrir a BD Biosciences, 10975 Torreyana Rd, San Diego, CA 92121, y se le reembolsará el importe pagado. Para obtener información sobre espectros de fluorocromos y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web de citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para conocer los protocolos técnicos.