BD, 560767, Kit de fenotipado de Th17/Treg de ratón BD Pharmingen™

Aplicación: Citometría de flujo (probada durante el desarrollo)
Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2869367
Descripción: Descripción Componentes: 51-9006647 Cóctel de fenotipado de Th17/Treg de ratón 1,0 ml Contiene lo siguiente: CD4 PerCP-Cy5.5 de ratón (clon: RM4-5) IL-17A PE de ratón (clon: TC11-18H10.1) Foxp3 de ratón Alexa Fluor® 647 (clon: MF23) 51-9006124 Concentrado de fijación de Foxp3 de ratón (20x) 10 ml 51-9006125 Concentrado de permeabilización de Foxp3 de ratón (5x) 80 ml 51-2092KZ Inhibidor del transporte de proteínas BD GolgiStop™ (que contiene monensina) 0,7 ml El sistema inmunitario protege a los individuos de una amplia gama de microorganismos patógenos al tiempo que evita respuestas inmunitarias inapropiadas o extremas, como las respuestas autoinmunitarias que podrían ser dañinas. El grupo de células T CD4+ periféricas incluye múltiples subgrupos de células T funcionalmente distintos que surgen a través de la diferenciación tímica o como consecuencia de la expansión y diferenciación impulsada por antígenos de células T periféricas vírgenes. La respuesta temprana de las células T CD4+ vírgenes a la estimulación antigénica puede caracterizarse por una alta proliferación y un repertorio limitado de citocinas. Una mayor diferenciación produce células con un potencial más diverso para la expresión de citocinas. Dependiendo del equilibrio de citocinas locales, moléculas coestimuladoras, niveles de antígenos y factores genéticos, se pueden generar células efectoras/de memoria Th17 o células reguladoras T CD4+ inducibles (iTreg) a partir del grupo de células T CD4+ vírgenes. Además, el grupo de células T periféricas contiene células reguladoras T CD4+ naturales (nTreg) que se generan en el timo como una subpoblación funcionalmente madura de células T. Se han identificado subgrupos de linfocitos T CD4+ funcionalmente polarizados según sus patrones distintivos de secreción de citocinas, expresión de factores de transcripción y función. Como citocina característica, las células Th17 expresan altos niveles de interleucina-17A (IL-17A), mientras que las células Treg se caracterizan por la expresión del factor de transcripción FoxP3. Mediante la secreción de IL-17A y otros factores, las células Th17 reclutan y activan neutrófilos y median la respuesta inmunitaria contra bacterias y hongos extracelulares. Las células Th17 también participan en la mediación de respuestas autoinmunitarias. Las células Treg, tanto naturales como inducibles, pueden suprimir la función de otras células T o tipos celulares implicados en la respuesta inmunitaria mediante diversos mecanismos, incluidas las citocinas. De esta manera, las Treg protegen contra la respuesta del sistema inmunitario a antígenos propios y limitan la respuesta excesiva a antígenos extraños que podrían ser perjudiciales para el huésped. El paradigma Th17/Treg proporciona un sistema modelo útil para investigar los mecanismos celulares y moleculares que median las respuestas inmunitarias, tanto protectoras como dañinas, incluyendo enfermedades autoinmunes. El kit de fenotipado BD Mouse Th17/Treg proporciona una combinación tricolor fácil de usar de anticuerpos fluorescentes —específicos para CD4 de ratón, IL-17A (para Th17) y Foxp3 (para Treg)— que permitirá a los investigadores identificar y caracterizar la naturaleza de los tipos de linfocitos T CD4+ presentes en su sistema mediante análisis de citometría de flujo multicolor. El kit puede utilizarse para analizar con éxito muestras de células linfoides ex vivo (p. ej., para los tipos de subconjuntos de linfocitos T CD4+ de ratón generados in vivo) o para monitorizar la diferenciación de linfocitos T CD4+ de células cultivadas en diversos sistemas modelo experimentales. Los investigadores deben tener en cuenta que el color del inhibidor del transporte de proteínas BD GolgiStop™ puede variar de transparente (incoloro) a amarillo claro.
Preparación y almacenamiento: Preparación y almacenamiento Almacenar sin diluir a 4 °C y protegido de la exposición prolongada a la luz. No congelar. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo de tejidos o ascitis por cromatografía de afinidad. El anticuerpo se conjugó con R-PE en condiciones óptimas y se eliminaron el anticuerpo no conjugado y el PE libre. El anticuerpo se conjugó con PerCP-Cy5.5 en condiciones óptimas y se eliminaron el anticuerpo no conjugado y el PerCP-Cy5.5 libre. No se recomienda el almacenamiento de conjugados de PerCP-Cy5.5 en diluyentes no optimizados, ya que puede resultar en la pérdida de intensidad de la señal. El anticuerpo se conjugó con Alexa Fluor® 647 en condiciones óptimas y se eliminó el Alexa Fluor® 647 que no reaccionó.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados A. Estimulación de las células Se han descrito varios métodos para la polarización y estimulación de subconjuntos de células T auxiliares para producir IL-17 in vitro. La activación a corto plazo con acetato de miristato de forbol (PMA; activador de la proteína quinasa C) más ionomicina (ionóforo de Ca2+) ha sido útil para inducir y caracterizar rápidamente células policlonales productoras de citocinas. Sin embargo, la estimulación ex vivo de células linfoides recién explantadas de ratones con PMA e ionomicina en cultivo durante varias horas suele dar como resultado la detección de solo un pequeño porcentaje de células productoras de IL-17A. Para este kit, recomendamos una polarización de 5 días de células T CD4+ enriquecidas cultivadas en presencia de TGFβ seguida de una reestimulación de 4 horas con PMA + ionomicina en presencia de BD GolgiStop™ Protein Transport Inhibitor. Nota: Se requieren estudios cinéticos para determinar el tiempo de incubación óptimo para cada sistema experimental. Procedimiento para la generación de células productoras de IL-17A de ratón: 1. Prepare una suspensión unicelular de esplenocitos de un ratón BALB/c. 2. Lise los glóbulos rojos (1x tampón de lisis BD PharmLyse™, n.° de cat. 555899). 3. Aísle los linfocitos T CD4+ mediante un método de selección celular negativo o positivo. 4. Cultivar las células durante cuatro días en presencia de anticuerpo anti-CD3 unido a placa (n.° de cat. 553057; 10 μg/ml; recubrir los pocillos de la placa de cultivo tisular durante la noche a 4 °C; lavar los pocillos tres veces con PBS de Dulbecco), anticuerpo anti-CD28 soluble (n.° de cat. 553294; ​​concentración final de 2 µg/ml) y proteínas recombinantes de ratón IL-1β (n.° de cat. 554577; 50 ng/ml), IL-6 de ratón (n.° de cat. 554582; 25 ng/ml) y TGFβ (n.° de cat. 356039; 5 ng/ml) en medio de cultivo tisular RPMI-1640 completo. Añadir medio fresco al tercer o cuarto día si es necesario. 5. El día 5, recolecte las células y lávelas una vez con medio de cultivo tisular RPMI-1640 completo. 6. Reestimule las células con 50 ng/ml de PMA (Sigma, n.° de cat. P-8139) y 1 µg/ml de ionomicina (Sigma, n.° de cat. I-0634) en presencia de monensina (inhibidor del transporte de proteínas BD Golgistop™ (incluido), n.° de cat. 554724) en RPMI-1640 completo. Incube las células de cuatro a cinco horas. 7. Recoja las células. 8. Lave las células una vez en tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS)* (n.° de cat. 554656). 9. Fije las células según el procedimiento de tinción con Foxp3 descrito a continuación. Opcional (las células pueden congelarse y almacenarse para su uso posterior tras la fijación) 1. Fije las células con 1× tampón de fijación BD Pharmingen™ Mouse Foxp3 (suministrado, n.º de cat. 560409) a una concentración de 10 millones de células/ml durante 30 minutos en hielo. 2. Lave las células una vez en tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS)* (5 ml de tampón de lavado por cada 10 millones de células). 3. Cuente las células y suspenda las células a 10 millones de células/ml en DMSO al 10 %/FCS al 90 %. 4. Congele las células a -80 °C en un vial para congelador. B. Tinción de las células Recoja las células de los cultivos celulares estimulantes mediante centrifugación (300x g) y suspéndalas en tampón de tinción BD Pharmingen (FBS)*. Cuente las células y ajuste su concentración a 10 millones de células/ml en tampón de tinción BD Pharmingen (FBS)*. Para células congeladas, retire el DMSO lavando las células descongeladas con 5 ml/vial congelado con tampón de tinción BD Pharmingen (FBS)* y centrifugue a 300x g durante 5 minutos a TA. Suspenda el sedimento a 10 millones de células/ml en tampón de tinción BD Pharmingen (FBS)* y alícuota 1 millón de células por pocillo de una placa de 96 pocillos. Centrifugue, retire el tampón y continúe el procedimiento en el paso 7. Nota sobre el procedimiento de tinción: Este procedimiento es para teñir células en placas de 96 pocillos con fondo en U. Si se prefiere teñir las células en tubos, ajuste los volúmenes de lavado a 1 ml. 1. Retire los grumos de células o los residuos pasando la suspensión celular a través de un colador de células de nailon BD Falcon™ de 70 μm (n.º de cat. 352235). 2. Diluir las células a 10 millones de células/ml. 3. Alicuotar 1 millón de células por pocillo, centrifugar a 300x g durante 5 minutos y retirar el fijador. 4. Para fijar las células, suspender suavemente el pellet celular en el volumen residual del fijador y añadir 200 µl de tampón de fijación BD Pharmingen™ Mouse Foxp3 1× frío recién preparado (incluido, n.º de cat. 560409). Mezclar bien. Incubar durante 30 minutos a 4 °C en oscuridad. 5. Centrifugar a 300x g durante 5 minutos y retirar el fijador. 6. Para lavar las células, suspenda cada pellet en 200 µl de tampón de permeabilización BD Pharmingen™ Mouse Foxp3 1× recién preparado y precalentado (37 °C) (incluido, n.º de cat. 560409) y centrifugue a 300 x g durante 5 minutos. Retire el tampón de permeabilización. 7. Para permeabilizar las células, suspenda suavemente el pellet en otros 200 µl de tampón de permeabilización BD Pharmingen™ Mouse Foxp3 1× recién preparado y precalentado (37 °C). Incube durante 30 minutos a 37 °C en oscuridad. 8. Centrifugue las células a 300 x g durante 5 minutos y retire el tampón. 9. Para lavar las células, agregue 200 µl de tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS) a cada tubo, centrifugue 300x g durante 5 minutos. Retire el tampón. Repita. 10. Agregue 20 µl/prueba del cóctel de fenotipado Th17/Treg de ratón o un control de tinción negativo apropiado. Incube a TA durante 30 minutos en la oscuridad. Las células deben protegerse de la luz durante la tinción y el almacenamiento. 11. Repita el paso de lavado 9 anterior dos veces. 12. Suspenda el sedimento celular en 200 µl de tampón de tinción y proceda con el análisis de citometría de flujo. C. Análisis de citometría de flujo Establezca el voltaje y la compensación de PMT utilizando células no teñidas y marcadores de superficie celular apropiados Nota: Se ha informado que la expresión de CD4 en células T disminuye después de la activación celular. * Se recomienda el tampón de tinción BD Pharmingen (FBS) (n.º de cat. 554656) para la tinción inicial de la superficie y todos los pasos de lavado, así como para cubrir los tubos durante los pasos de incubación con tapas o parafilm. Advertencias y precauciones Peligro: El inhibidor del transporte de proteínas BD GolgiStop™ (componente 51-2092KZ) contiene un 99,61 % de etanol (p/p) y un 0,26 % de monensina, sal monosódica (p/p). Indicaciones de peligro: Líquido y vapores muy inflamables. Provoca irritación ocular grave. Declaraciones de precaución: Mantener alejado del calor, chispas, llamas abiertas y superficies calientes. No fumar. Llevar guantes y gafas de protección. Llevar ropa de protección. EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL (o el pelo): Quítese inmediatamente toda la ropa contaminada. Enjuague la piel con agua o dúchese. EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Enjuague cuidadosamente con agua durante varios minutos. Quítese las lentes de contacto, si lleva y resulta fácil. Siga enjuagando. Eliminar el contenido/el recipiente de acuerdo con las regulaciones locales/regionales/nacionales/internacionales. Peligro: Concentrado de fijación Foxp3 para ratón (20x) (componente 51-9006124) contiene 4,2% de formaldehído (p/p). Indicaciones de peligro Nocivo si se inhala. Provoca irritación cutánea. Provoca lesiones oculares graves. Puede provocar una reacción alérgica en la piel. Se sospecha que provoca defectos genéticos. Puede provocar cáncer. Vía de exposición: Inhalatorio. Puede causar irritación respiratoria. Consejos de precaución Llevar ropa protectora/protección ocular. Llevar guantes de protección. No respirar la niebla/los vapores/el aerosol. EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Aclarar cuidadosamente con agua durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto, si lleva y resulta fácil. Seguir aclarando. En caso de irritación o sarpullido en la piel: Consultar a un médico.
Avisos del producto: Avisos del producto Tenga en cuenta las siguientes precauciones: La absorción de luz visible puede alterar significativamente la transferencia de energía que ocurre en cualquier conjugado de fluorocromo en tándem; por lo tanto, recomendamos tomar precauciones especiales (como envolver viales, tubos o gradillas en papel de aluminio) para evitar la exposición de los reactivos conjugados, incluidas las células teñidas con esos reactivos, a la iluminación ambiental. La emisión del fluorocromo Alexa Fluor® 647 se recoge con la misma configuración del instrumento que para la aloficocianina (APC). Los anticuerpos marcados con PerCP-Cy5.5 se pueden usar con reactivos marcados con FITC y R-PE en citómetros de flujo de láser único sin superposición espectral significativa de la fluorescencia de PerCP-Cy5.5, FITC y R-PE. PerCP-Cy5.5 está optimizado para su uso con un solo láser de iones de argón que emite luz de 488 nm. Debido al amplio espectro de absorción del fluorocromo en tándem, se debe tener especial cuidado al usar citómetros de láser dual, que pueden excitar directamente tanto PerCP como Cy5.5™. Recomendamos el uso de compensación de haz cruzado durante la adquisición de datos o compensación de software durante el análisis de datos. Alexa Fluor® es una marca registrada de Molecular Probes, Inc., Eugene, OR. Los conjugados de anticuerpos de los colorantes Alexa Fluor®, Pacific Blue™ y Cascade Blue® en este producto se venden bajo licencia de Molecular Probes, Inc. solo para uso en investigación, excluyendo el uso en combinación con microarrays o como reactivos específicos de analitos. Los colorantes Alexa Fluor® (excepto Alexa Fluor® 430), el colorante Pacific Blue™ y el colorante Cascade Blue® están cubiertos por patentes pendientes y emitidas. Cy es una marca registrada de Amersham Biosciences Limited. Este producto conjugado se vende bajo licencia de las siguientes patentes: Patentes de EE. UU. n.º 5.486.616; 5.569.587; 5.569.766; 5.627.027. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Este producto está sujeto a los derechos de propiedad de Amersham Biosciences Corp. y la Universidad Carnegie Mellon, y se fabrica y vende bajo licencia de Amersham Biosciences Corp. Este producto tiene licencia de venta únicamente para investigación. No tiene licencia para ningún otro uso. Si necesita una licencia comercial para usar este producto y no la tiene, devuelva este material, sin abrir, a BD Biosciences, 10975 Torreyana Rd, San Diego, CA 92121 y se le reembolsará el dinero pagado por el material. Para obtener información sobre los espectros de fluorocromos y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web sobre citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. Para consultar los protocolos técnicos, visite www.bdbiosciences.com/us/s/resources.