BD, 561382, BD Horizon™ V450 Anti-IFN-α[2b] humano de ratón

Nombre alternativo: IFNa, IFNα
Reactividad: Humana (Pruebas de control de calidad)
Isotipo: IgG1 de ratón, κ
Inmunógeno: IFN-α2b humano
Aplicación: Tinción intracelular (citometría de flujo) (Probado rutinariamente)
Vol. por prueba: 5 µl
ID de registro: AB_10716058
Tampón de almacenamiento: Solución tamponada acuosa que contiene estabilizador de proteínas y ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad. El anticuerpo se conjugó con BD Horizon™ V450 en condiciones óptimas y se eliminó el BD Horizon™ V450 no reaccionado. Conservar sin diluir a 4 °C y protegido de la exposición prolongada a la luz. No congelar.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados PROCEDIMIENTO Activación celular Nota: El siguiente procedimiento de activación celular debe realizarse en una campana de cultivo tisular utilizando una técnica aséptica. 1. Aísle células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) frescas de 60 ml de sangre fresca y lave dos veces con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS) estéril 1X. Centrifugue las células a 250 g durante 10 minutos y deseche el sobrenadante. 2. Suspenda las células en medio de cultivo tisular completo (RPMI suplementado con 1% de Pen/Strep, 1% de L-glutamina y 10% de suero fetal bovino). Cuente y ajuste la concentración celular a 2 a 3 millones de células/ml. 3. Etiquete dos tubos cónicos estériles de 50 ml como "No estimulado" y "Estimulado con CpG". Dispensar PBMC a cada tubo (2 millones de células/prueba). 4. Añadir 5 µg de oligodesoxinucleótido CpG (Coley Pharmaceutical Co., n.º de cat. 2336) por ml de células al tubo "Estimulado con CpG". Tapar el tubo y agitar suavemente en vórtex. 5. Incube ambos tubos durante 2 horas a 37 °C. 6. Diluir la solución BD FastImmune™ de Brefeldina A (BFA) (n.º de cat. 347688) en una proporción de 1 a 10 en PBS 1X estéril. 7. Añadir 20 µl de BFA 1X por ml a ambos tubos ("No estimulado" y "Estimulado con CpG"). Incube los tubos a 37 °C durante 2 horas. Nota: Mantener las alícuotas de CPG y BFA a -20 °C. 8. Añada 100 µl de EDTA 20 mM (Sigma Cat. N.° E7889) por ml de células a ambos tubos e incube durante la noche a 4 °C. Tinción superficial e intracelular. 9. Centrifugue los dos tubos a 250 g durante 10 minutos. Deseche los sobrenadantes por aspiración y resuspenda las células en 25 ml de tampón de tinción (FBS) BD Pharmingen™ (Cat. N.° 554656). 10. Centrifugue los tubos a 250 g durante 10 minutos. Deseche los sobrenadantes y resuspenda las células en tampón de tinción (FBS) a 20 millones por ml. 11. Etiquete adecuadamente 12 tubos de polipropileno de 75 mm. Añada 100 µl de células a cada tubo. 12. Añada los anticuerpos de tinción de superficie a cada tubo: Lin-1 FITC humano (n.º de cat. 340546), CD123 PerCPCy5.5 humano (n.º de cat. 558714/560904) y HLA-DR APC humano (n.º de cat. 559868). Incube los tubos a temperatura ambiente durante 30 minutos en oscuridad. 13. Tras la incubación, añada 2 ml de tampón de tinción (FBS) frío a cada tubo y centrifugue a 250 g durante 10 minutos. Deseche los sobrenadantes por aspiración y agite los pellets para resuspender las células. 14. Añada 1 ml de tampón BD Cytofix/Cytoperm a temperatura ambiente (n.º de cat. 554722) a cada tubo. Mezcle bien e incube a temperatura ambiente en oscuridad durante 30 minutos. 15. Añada 2 ml de tampón BD Perm/Wash™ frío (n.° de cat. 554723) a cada tubo y centrifugue a 500 g durante 5 minutos; deseche los sobrenadantes por aspiración y agite los pellets en vórtex para resuspender las células. Repita el paso de lavado. 16. Añada el anticuerpo de tinción intracelular fluorescente, BD Horizon™ V450 Mouse Anti-Human IFN-α2b (IFN-α2b; n.° de cat. 561382; 5 µl/prueba), o el control de isotipo de inmunoglobulina fluorescente adecuado, al volumen adecuado por prueba, a los tubos y mezcle bien mediante vórtex. Lleve el volumen de prueba a 100 µl con tampón BD Perm/Wash frío. Incube los tubos a temperatura ambiente durante 60 minutos en oscuridad. 17. Agregue 2 mL de tampón de lavado/permanencia BD frío a cada tubo y centrifugue a 500 g durante 5 minutos; deseche el sobrenadante por aspiración y agite el pellet en vórtex para suspender las células. 18. Agregue 500 µl de tampón de tinción frío a cada tubo para un análisis citométrico de flujo inmediato. Opcional: resuspenda los pellets celulares con 200 µl de solución fría de formaldehído al 1% y mantenga los tubos a 4 °C en la oscuridad hasta 24 horas antes de la citometría de flujo. Si se almacenan durante más de 24 horas, recomendamos lavar las células en tampón de tinción (FBS), ya que la incubación prolongada con fijadores puede afectar a los fluorocromos. Citometría de flujo y análisis de datos Adquiera al menos 500 000 eventos (linfocitos y monocitos). Se requiere una estrategia de selección secuencial para un análisis de datos exitoso: 1. Seleccione con precisión los linfocitos y monocitos utilizando los perfiles de dispersión de luz frontal y lateral. 2. Observe el perfil Lin-1 frente a HLA-DR de los linfocitos y monocitos seleccionados y seleccione la población Lin-1-negativa y HLA-DR-positiva. Asegúrese de no incluir ninguna de las células Lin-1-positivas. 3. Observe el perfil IFN-alfa2b (IFN-alfa) frente a CD123 de las células seleccionadas para detectar la población celular IFN-alfa-positiva. La muestra "No Estimulada" se utiliza como control negativo para establecer marcadores que midan la frecuencia de células IFN-α2b-positivas (IFN-alfa-positivas). Abra la segunda puerta en células Lin-1- HLA-DR+ y, a partir de ahí, abra la tercera puerta para células CD123+ IFN-alfa+. Adquiera entre 150 y 200 eventos en el cuadrante de células CD123+ IFN-alfa+ doblemente positivas.
Avisos del producto: Avisos del producto Este reactivo ha sido prediluido para su uso al volumen recomendado por prueba. Normalmente usamos 1 × 10^6 células en una muestra experimental de 100 µl (una prueba). Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para conocer los protocolos técnicos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Para conocer los espectros de fluorocromos y los ajustes adecuados del instrumento, consulte nuestra página web de citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. BD Horizon V450 tiene una absorción máxima de 406 nm y una emisión máxima de 450 nm. Antes de teñir con este reactivo, confirme que su citómetro de flujo es capaz de excitar el fluorocromo y discriminar la fluorescencia resultante. Pacific Blue™ es una marca comercial de Molecular Probes, Inc., Eugene, OR.