BD, 561431, BD Pharmingen™ PerCP-Cy™5.5 Anexina V

Reactividad: Humana (Pruebas de control de calidad)
Isotipo: nulo nulo
Aplicación: Citometría de flujo (probada rutinariamente)
Vol. por prueba: 5 µl
ID de registro: AB_10714630
Tampón de almacenamiento: Solución tamponada acuosa que contiene BSA y ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad. El anticuerpo se conjugó con PerCP-Cy5.5 en condiciones óptimas, eliminándose el anticuerpo no conjugado y el PerCP-Cy5.5 libre. No se recomienda almacenar los conjugados de PerCP-Cy5.5 en un diluyente no optimizado, ya que puede provocar una pérdida de intensidad de la señal. Conservar sin diluir a 4 °C y protegido de la luz. No congelar.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados PerCP-Cy™5.5 Annexin V es una sonda sensible para identificar células apoptóticas, que se une a superficies de fosfolípidos con carga negativa con una mayor afinidad por la fosfatidilserina (PS) que la mayoría de los demás fosfolípidos. La unión de PerCP-Cy™5.5 Annexin V depende del calcio y se requieren concentraciones definidas de calcio y sal para una tinción óptima, como se describe en el Protocolo de tinción de PerCP-Cy™5.5 Annexin V. Los investigadores deben tener en cuenta que el análisis de citometría de flujo de PerCP-Cy™5.5 Annexin V en tipos de células adherentes (p. ej., HeLa, NIH 3T3, etc.) no se prueba de forma rutinaria, ya que puede producirse un daño específico de la membrana durante el desprendimiento o la recolección de células. Sin embargo, se han informado previamente métodos para utilizar Annexin V para citometría de flujo en tipos de células adherentes (Casiola-Rosen et al. y van Engelend et al.). INDUCCIÓN DE APOPTOSIS POR CAMPTOTECINA El siguiente protocolo se proporciona como una ilustración de cómo se puede usar PerCP-Cy™5.5 Annexin V en una línea celular (Jurkat). Materiales 1. Prepare la solución madre de camptotecina (Sigma-Aldrich Cat. No. C-9911): 1 mM en DMSO. 2. Células T Jurkat (ATCC TIB-152). Procedimiento 1. Añada camptotecina (concentración final 4-6 µM) a 1 × 10^6 células Jurkat. 2. Incube las células durante 4-6 horas a 37 °C. 3. Proceda con el protocolo de tinción de PerCP-Cy™5.5 Annexin V para medir la apoptosis. PROTOCOLO DE TINCIÓN DE PerCP-Cy™5.5 ANEXIN V Reactivos 1. PerCP-Cy™5.5 Annexin V: Incluido. Utilice 5 µl por prueba. 2. Tampón de unión de anexina 10X: No incluido. Hepes 0,1 M (pH 7,4), NaCl 1,4 M, CaCl2 25 mM. Almacenar a 4 °C. Alternativamente, puede adquirir el tampón de unión de anexina V BD Pharmingen™, concentrado 10X (n.º de cat. 556454). Tinción 1. Lave las células dos veces con PBS frío y luego resuspenda las células en tampón de unión 1× a una concentración de 1 × 10^6 células/ml. 2. Transfiera 100 µl de la solución (1 × 10^5 células) a un tubo de cultivo de 5 ml. 3. Añada 5 µl de PerCP-Cy™5.5 Anexina V. 4. Agite suavemente las células e incube durante 15 min a TA (25 °C) en oscuridad. 5. Añada 400 µl de tampón de unión 1× a cada tubo. Analice mediante citometría de flujo en 1 hora. CONTROLES SUGERIDOS PARA CONFIGURAR LA CITOMETRÍA DE FLUJO Los siguientes controles se utilizan para configurar marcadores para cuantificar células PerCP-Cy™5.5 Annexin V-positivas: 1. Células sin teñir. 2. Células teñidas solo con PerCP-Cy™5.5 Annexin V. Otros controles de tinción Se debe utilizar una línea celular que pueda inducirse fácilmente a sufrir apoptosis para obtener una tinción de control positiva con PerCP-Cy™5.5 Annexin V. Es importante tener en cuenta que el nivel basal de apoptosis y necrosis varía considerablemente dentro de una población. Por lo tanto, incluso en ausencia de apoptosis inducida, la mayoría de las poblaciones celulares contendrán un pequeño porcentaje de células que sean positivas para la apoptosis (células PerCP-Cy™5.5 Annexin V positivas). La población no tratada se utiliza para definir el nivel basal de células apoptóticas y muertas. El porcentaje de células inducidas a apoptosis se determina restando el porcentaje de células apoptóticas de la población no tratada del porcentaje de células apoptóticas de la población tratada.
Avisos del producto: Avisos del producto Tenga en cuenta las siguientes precauciones: La absorción de luz visible puede alterar significativamente la transferencia de energía que se produce en cualquier conjugado de fluorocromo en tándem; por lo tanto, recomendamos tomar precauciones especiales (como envolver los viales, tubos o gradillas en papel de aluminio) para evitar la exposición de los reactivos conjugados, incluidas las células teñidas con dichos reactivos, a la iluminación ambiental. PerCP-Cy5.5 está optimizado para su uso con un solo láser de iones de argón que emite luz de 488 nm. Debido al amplio espectro de absorción del fluorocromo en tándem, se debe tener especial cuidado al utilizar citómetros de láser dual, que pueden excitar directamente tanto a PerCP como a Cy5.5™. Recomendamos el uso de compensación de haz cruzado durante la adquisición de datos o compensación de software durante el análisis de datos. Los anticuerpos marcados con PerCP-Cy5.5 se pueden usar con reactivos marcados con FITC y R-PE en citómetros de flujo de láser único sin superposición espectral significativa de la fluorescencia de PerCP-Cy5.5, FITC y R-PE. Este producto está sujeto a los derechos de propiedad de Amersham Biosciences Corp. y la Universidad Carnegie Mellon, y se fabrica y vende bajo licencia de Amersham Biosciences Corp. Este producto tiene licencia de venta únicamente para investigación. No tiene licencia para ningún otro uso. Si necesita una licencia comercial para usar este producto y no la tiene, devuelva este material, sin abrir, a BD Biosciences, 10975 Torreyana Rd, San Diego, CA 92121 y se le reembolsará cualquier dinero pagado por el material. Cy es una marca registrada de Amersham Biosciences Limited. Este producto conjugado se vende bajo licencia de las siguientes patentes: Patentes de EE. UU. n.º 5.486.616; 5.569.587; 5.569.766; 5.627.027. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA, ubicados en Estados Unidos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Para obtener información sobre los espectros de fluorocromos y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web sobre citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. Consulte los protocolos técnicos en www.bdbiosciences.com/us/s/resources.