BD, 561501, BD Horizon™ V500 Anexina V

Reactividad: Humana (Pruebas de control de calidad)
Aplicación: Citometría de flujo (probada rutinariamente)
Vol. por prueba: 5 µl
ID de registro: AB_10694254
Tampón de almacenamiento: solución tamponada acuosa que contiene BSA, estabilizador de proteínas y ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C y protegido de la luz. No congelar. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad. El anticuerpo se conjugó con BD Horizon™ V500 en condiciones óptimas y se eliminó el BD Horizon™ V500 que no reaccionó.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados BD™ Horizon V500 Annexin V es una sonda sensible para identificar células apoptóticas, que se une a superficies de fosfolípidos con carga negativa con una mayor afinidad por la fosfatidilserina (PS) que la mayoría de los demás fosfolípidos. La unión de V500 Annexin V depende del calcio. Por lo tanto, se requieren concentraciones definidas de calcio y sal para una tinción óptima, como se describe en el Protocolo de tinción de V500 Annexin V. Los investigadores deben tener en cuenta que el análisis de citometría de flujo de V500 Annexin V en tipos de células adherentes (p. ej., HeLa, NIH 3T3, etc.) no se prueba de forma rutinaria, ya que puede producirse un daño específico de la membrana durante el desprendimiento o la recolección de células. Sin embargo, se han informado previamente métodos para utilizar Annexin V para citometría de flujo en tipos de células adherentes (Casiola-Rosen et al. y van Engelend et al.). INDUCCIÓN DE APOPTOSIS POR CAMPTOTECINA El siguiente protocolo se proporciona como una ilustración de cómo se puede utilizar la Anexina V V500 en una línea celular (Jurkat). Materiales 1. Prepare la solución madre de camptotecina (Sigma-Aldrich Cat. No. C-9911): 1 mM en DMSO. 2. Células T Jurkat (ATCC TIB-152). Procedimiento 1. Añada camptotecina (concentración final 4-6 µM) a 1 × 10^6 células Jurkat. 2. Incube las células durante 4-6 horas a 37 °C. 3. Proceda con el Protocolo de tinción de Anexina V V500 para medir la apoptosis. PROTOCOLO DE TINCIÓN DE ANEXINA V V500 Reactivos 1. Anexina V V500: Incluida. Utilice 5 µl por prueba. 2. 7-Amino-Actinomicina D (7-AAD): No incluido. El 7-AAD (n.° de cat. 559925) es un colorante de ácido nucleico práctico y listo para usar, con fluorescencia detectable en el rango rojo lejano del espectro. Use 5 µl por prueba. 3. Tampón de unión de anexina 10X: No incluido. Hepes 0,1 M (pH 7,4), NaCl 1,4 M, CaCl₂ 25 mM. Conservar a 4 °C. Como alternativa, puede adquirir el tampón de unión de anexina V BD Pharmingen™, concentrado 10X (n.° de cat. 556454). Tinción: 1. Lave las células dos veces con PBS frío y, a continuación, resuspéndalas en tampón de unión 1X a una concentración de 1 × 10^6 células/ml. 2. Transferir 100 µl de la solución (1 × 10^5 células) a un tubo de cultivo de 5 ml. 3. Añadir 5 µl de V500 Annexin V (para análisis de uno y dos colores) y 5 µl de 7-AAD (solo para análisis de dos colores). 4. Agitar suavemente las células e incubar durante 15 min a TA (25 °C) en la oscuridad. 5. Añadir 400 µl de 1× Binding Buffer a cada tubo. Analizar por citometría de flujo en 1 hora. CONTROLES SUGERIDOS PARA CONFIGURAR LA CITOMETRÍA DE FLUJO Los siguientes controles se utilizan para configurar la compensación y los cuadrantes: 1. Células sin teñir. 2. Células teñidas solo con V500 Annexin V (sin 7-AAD). 3. Células teñidas solo con 7-AAD (sin V500 Annexin V). Otros controles de tinción: Se debe utilizar una línea celular que pueda inducirse fácilmente a apoptosis para obtener una tinción de control positiva con V500 Annexin V y/o V500 Annexin V y 7-AAD. Es importante destacar que el nivel basal de apoptosis y necrosis varía considerablemente dentro de una población. Por lo tanto, incluso en ausencia de apoptosis inducida, la mayoría de las poblaciones celulares contendrán un pequeño porcentaje de células que son positivas para la apoptosis (V500 Annexin V positivo, 7-AAD negativo o V500 Annexin V positivo, 7-AAD positivo). La población no tratada se utiliza para definir el nivel basal de células apoptóticas y muertas. El porcentaje de células que han sido inducidas a apoptosis se determina entonces restando el porcentaje de células apoptóticas en la población no tratada del porcentaje de células apoptóticas en la población tratada. Dado que la muerte celular es el resultado final de las células que experimentan apoptosis, las células en las últimas etapas de la apoptosis tendrán una membrana dañada y se teñirán de forma positiva para 7-AAD así como para V500 Annexin V. Por lo tanto, el ensayo no distingue entre células que ya han experimentado una muerte celular apoptótica y aquellas que han muerto como resultado de la vía necrótica, porque en cualquier caso las células muertas se teñirán tanto con V500 Annexin V como con 7-AAD.
Avisos del producto: Avisos del producto Este reactivo ha sido prediluido para su uso al volumen recomendado por prueba. Normalmente usamos 1 × 10^6 células en una muestra experimental de 100 µl (una prueba). La fuente de todas las proteínas séricas proviene de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en los Estados Unidos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. BD Horizon V500 tiene una absorción máxima de 415 nm y una emisión máxima de 500 nm. Antes de teñir con este reactivo, confirme que su citómetro de flujo es capaz de excitar el fluorocromo y discriminar la fluorescencia resultante. Para conocer los espectros de fluorocromo y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web de citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para conocer los protocolos técnicos.