BD, 561526, Kit de análisis de linaje neuronal humano BD Stemflow™

Reactividad: Humana (Pruebas de control de calidad)
Aplicación: Citometría de flujo (probada rutinariamente)
Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2869383
Descripción: El kit de análisis de linaje neuronal humano BD Stemflow™ contiene una combinación de conjugados de anticuerpos monoclonales de ratón para el análisis de cultivos de diferenciación neuronal. Las especificidades de los anticuerpos que se proporcionan en este kit y las poblaciones de células neuronales que pueden identificar se enumeran en la tabla a continuación. Los componentes de anticuerpos de este kit se pueden utilizar individualmente o en combinaciones de hasta cuatro. Todos los anticuerpos de este kit han sido verificados mediante Western blot y análisis de imagen. Hay formatos de anticuerpos adicionales que pueden permitir paneles más complejos disponibles en www.bdbiosciences.com. El kit también incluye el tampón de fijación BD Cytofix™ y el tampón de permeación BD Phosflow™ III. Componentes del kit Componente Descripción Tamaño Vol. Tampón de almacenamiento por prueba 51-9007227 PerCP-Cy™5.5 Anti-Sox2 de ratón 25 Prueba 5 µl Solución tamponada acuosa que contiene BSA y ≤ 0,09 % de azida sódica 51-9007228 Alexa Fluor® 647 Anti-GFAP de ratón 25 Prueba 5 µl Solución tamponada acuosa que contiene BSA y ≤ 0,09 % de azida sódica 51-9007229 PE Anti-Doublecortin de ratón 25 Prueba 5 µl Solución tamponada acuosa que contiene BSA y ≤ 0,09 % de azida sódica 51-9007230 Alexa Fluor® 647 Anti-Nestin de ratón 25 Prueba 5 µl Solución tamponada acuosa que contiene BSA y ≤ 0,09 % de azida sódica 51-9007231 Alexa Fluor® 488 Anti-Humano Ki-67 de ratón 25 Prueba 5 µl Solución tampón acuosa que contiene BSA y ≤ 0,09 % de azida sódica 51-9007232 PerCP-Cy™5.5 Anti-Humano Sox1 de ratón 25 Prueba 5 µl Solución tampón acuosa que contiene BSA y ≤ 0,09 % de azida sódica 51-9007233 FITC Anti-Humano CD44 de ratón 25 Prueba 5 µl Solución tampón acuosa que contiene BSA y ≤ 0,09 % de azida sódica 51-9006607 Tampón Perm III 50 ml 51-9006276 Tampón de fijación 50 ml Especificidad Clon Molécula Población de células neuronales identificada CD44 G44-26 H-CAM Células gliales, astrocitos, precursores de astrocitos Ki-67 B56 Marcador de proliferación nuclear Todos los tipos de células proliferantes Doblecortina 30/Doblecortina Neurofilamento Neuronas postmitóticas inmaduras Sox2 O30-678 Factor de transcripción Células gliales, células madre embrionarias y neurales Sox1 N23-844 Factor de transcripción Células gliales y células madre neurales GFAP 1B4 Filamento Astrocitos Nestina 25/Filamento de Nestina Células gliales, astrocitos, células madre embrionarias y neurales
Preparación y almacenamiento: Preparación y almacenamiento Almacenar sin diluir a 4 °C y protegido de la exposición prolongada a la luz. No congelar. El anticuerpo se conjugó con R-PE en condiciones óptimas y se eliminaron el anticuerpo no conjugado y el PE libre. El anticuerpo se conjugó con Alexa Fluor® 488 en condiciones óptimas y se eliminó el Alexa Fluor® 488 que no reaccionó. El anticuerpo se conjugó con PerCP-Cy5.5 en condiciones óptimas y se eliminaron el anticuerpo no conjugado y el PerCP-Cy5.5 libre. No se recomienda el almacenamiento de conjugados de PerCP-Cy5.5 en un diluyente no optimizado, ya que puede provocar la pérdida de intensidad de la señal. El anticuerpo se conjugó con FITC en condiciones óptimas y se eliminó el FITC que no reaccionó. El anticuerpo se conjugó con Alexa Fluor® 647 en condiciones óptimas y se eliminó el Alexa Fluor® 647 que no reaccionó.
Procedimientos de ensayo recomendados: (1) Separe las células de interés de la placa de cultivo. Se recomienda a los investigadores separar las células a 37 °C con la solución de separación celular Accutase™ (n.° de cat. 561527). El desprendimiento puede tardar hasta 45 minutos con una trituración de leve a moderada de la suspensión celular. (2) Lave las células en PBS 1X y fíltrelas con un filtro celular Falcon® de 70 μm (Corning, n.° de cat. 352350). (3) Resuspenda las células en el tampón de fijación BD Cytofix™ (n.° de cat. 554655) e incube a temperatura ambiente durante 20 minutos en oscuridad. El volumen recomendado para la fijación celular es de 1 ml de tampón de fijación BD Cytofix™ por cada 10 millones de células, con un volumen mínimo de 200 µl. (4) Lave las células dos veces con PBS 1X. Si los investigadores desean continuar posteriormente, las células pueden congelarse y almacenarse en una solución de DMSO al 10 % + FBS al 90 % a -80 °C utilizando los métodos estándar para la criopreservación de células vivas. (5) Agitar en vórtex para aflojar las células y luego permeabilizarlas añadiendo lentamente BD Phosflow™ Perm Buffer III (n.º de cat. 558050) helado mientras se agita en vórtex. El volumen recomendado para permeabilizar las células es de 1 ml de BD Phosflow™ Perm Buffer III por cada 10 millones de células, con un volumen mínimo de 1 ml. (6) Incubar en hielo durante 30 minutos o, alternativamente, las células pueden almacenarse en BD Phosflow™ Perm Buffer III hasta 6 meses a -20 °C. (7) Lave las células dos veces con tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS) (n.º de cat. 554656) y resuspéndalas a una concentración de 5-10 millones de células/ml en tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS). Alternativamente, puede usar solución de lavado/tinción 1X (1 x PBS, 1 % FCS y 0,09 % de azida sódica). (8) Añada 100 µl de células a 12 tubos de poliestireno de 75 mm debidamente etiquetados. (9) Añada el panel de conjugados de anticuerpos que desee utilizar (5 µl/prueba de cada conjugado de anticuerpos) e incube en oscuridad durante 30 minutos. (10) Lave dos veces con 2 ml de tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS). (11) Resuspenda la muestra en un volumen adecuado (350-400 µl) de tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS) para analizarla en un citómetro de flujo. Consideraciones del kit: Elección de una enzima para el desprendimiento celular: Se recomienda a los investigadores utilizar la solución de desprendimiento celular Accutase™ (n.º de cat. 561527), ya que se ha observado que la muerte celular con este método de desprendimiento es mínima. Se pueden utilizar otros métodos según la confluencia y el número de células, como con tripsina al 0,05 %. Métodos de fijación y permeabilización: Todos los componentes de este kit son compatibles entre sí. Sin embargo, si se incluyen especificidades adicionales, se debe verificar que esos conjugados de anticuerpos funcionen con los tampones de fijación/permeabilización incluidos en este kit. Configuración del instrumento: Las partículas BD™ CompBead Plus (n.º de cat. 560497 o 560499) pueden ser beneficiosas para configurar el experimento en un citómetro de flujo. Se recomienda a los investigadores configurar los voltajes de PMT con las partículas BD™ CompBead Plus y verificar que los ajustes de voltaje sean los adecuados analizando una muestra de células teñidas antes de ejecutar el experimento completo. Análisis de datos: Se recomienda un enfoque de selección basado en grupos al analizar los datos. La selección retroactiva del perfil de dispersión puede ser útil, ya que las neuronas tienen una población de dispersión distintiva. En muchos cultivos de diferenciación neuronal, la expresión de GFAP puede tardar mucho tiempo (más de un mes). Hemos observado que la expresión de GFAP puede aumentarse cultivando células en medios formulados para el crecimiento de astrocitos (véase más adelante). En ocasiones, los restos celulares pueden filtrarse en la población neuronal, por lo que el uso de discriminadores de células vivas/muertas puede ser útil para delimitar la población neuronal. Poblaciones celulares: Este kit se ha desarrollado para su uso en poblaciones de células neuronales derivadas de células madre pluripotentes humanas mediante los métodos descritos en la leyenda de la figura a continuación. Este kit no se ha probado en otros tipos de células, incluidas las células primarias, y los resultados pueden diferir al examinar tipos de células de un origen diferente (p. ej., tinción de fondo más alta). En estos casos, los investigadores pueden encontrar útil usar controles de isotipo para distinguir la tinción de fondo no específica de la tinción de anticuerpos específicos. Advertencias y precauciones Peligro: BD Phosflow™ Perm Buffer III (componente 51-9006607) contiene 87,68 % de metanol (p/p). Indicaciones de peligro Líquido y vapores altamente inflamables. Tóxico si se ingiere, en contacto con la piel o si se inhala. Provoca daños en el sistema nervioso central. Vía de exposición: Oral. Declaraciones de precaución Mantener alejado del calor/chispas/llamas abiertas/superficies calientes. - No fumar. Usar ropa protectora/protección ocular. Usar guantes protectores. No respirar la niebla/los vapores/el aerosol. EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL (o el pelo): Quítese inmediatamente toda la ropa contaminada. Enjuague la piel con agua/dúchese. EN CASO DE INHALACIÓN: Transportar a la víctima al exterior y mantenerla en reposo en una posición confortable para respirar. Peligro: El tampón de fijación (componente 51-9006276) contiene 4,2 % de formaldehído (p/p). Indicaciones de peligro Nocivo si se inhala. Provoca irritación cutánea. Provoca lesiones oculares graves. Puede provocar una reacción alérgica en la piel. Se sospecha que provoca defectos genéticos. Puede provocar cáncer. Vía de exposición: Inhalatorio. Puede causar irritación respiratoria. Consejos de prudencia: Llevar ropa protectora / protección ocular. Llevar guantes de protección. No respirar la niebla/los vapores/el aerosol. EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Aclarar cuidadosamente con agua durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto, si lleva y resulta fácil. Seguir aclarando. En caso de irritación o sarpullido en la piel: Consultar a un médico.
Avisos del producto: Avisos del producto Tenga en cuenta las siguientes precauciones: La absorción de luz visible puede alterar significativamente la transferencia de energía que ocurre en cualquier conjugado de fluorocromo en tándem; por lo tanto, recomendamos tomar precauciones especiales (como envolver viales, tubos o gradillas en papel de aluminio) para evitar la exposición de los reactivos conjugados, incluidas las células teñidas con esos reactivos, a la iluminación ambiental. La emisión del fluorocromo Alexa Fluor® 488 se recoge con la misma configuración del instrumento que para el isotiocianato de fluoresceína (FITC). La emisión del fluorocromo Alexa Fluor® 647 se recoge con la misma configuración del instrumento que para la aloficocianina (APC). Alexa Fluor® es una marca registrada de Molecular Probes, Inc., Eugene, OR. Los conjugados de anticuerpos colorantes Alexa Fluor®, Pacific Blue™ y Cascade Blue® de este producto se venden bajo licencia de Molecular Probes, Inc. solo para uso en investigación, excluyendo el uso en combinación con microarrays o como reactivos específicos de analito. Los colorantes Alexa Fluor® (excepto Alexa Fluor® 430), Pacific Blue™ y Cascade Blue® están cubiertos por patentes pendientes y emitidas. Los anticuerpos marcados con PerCP-Cy5.5 pueden utilizarse con reactivos marcados con FITC y R-PE en citómetros de flujo de láser único sin superposición espectral significativa de la fluorescencia de PerCP-Cy5.5, FITC y R-PE. PerCP-Cy5.5 está optimizado para su uso con un láser de iones de argón que emite luz de 488 nm. Debido al amplio espectro de absorción del fluorocromo en tándem, se debe tener especial cuidado al utilizar citómetros de láser dual, ya que pueden excitar directamente tanto PerCP como Cy5.5™. Recomendamos el uso de compensación de haz cruzado durante la adquisición de datos o compensación de software durante el análisis de datos. Este producto conjugado con PerCP se vende bajo la licencia de la siguiente patente: Patente estadounidense n.º 4.876.190. Cy es una marca registrada de Amersham Biosciences Limited. Este producto conjugado se vende bajo licencia de las siguientes patentes: Patentes de EE. UU. n.º 5.486.616; 5.569.587; 5.569.766; 5.627.027. Este producto está sujeto a los derechos de propiedad de Amersham Biosciences Corp. y Carnegie Mellon University, y se fabrica y vende bajo licencia de Amersham Biosciences Corp. Este producto tiene licencia de venta únicamente para investigación. No tiene licencia para ningún otro uso. Si necesita una licencia comercial para usar este producto y no la tiene, devuelva este material sin abrir a BD Biosciences, 10975 Torreyana Rd, San Diego, CA 92121, y se le reembolsará el dinero pagado por el material. La fuente de todas las proteínas séricas proviene de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Para obtener información sobre los espectros de fluorocromos y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web sobre citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. Para conocer los protocolos técnicos, visite www.bdbiosciences.com/us/s/resources.