BD, 562158, Tinte de proliferación violeta BD Horizon™ 450

Aplicación: Tinción intracelular (citometría de flujo) (Probado rutinariamente)
ID de registro: AB_2869398
Estado regulatorio: RUO
Procedimientos de ensayo recomendados: Materiales proporcionados para los procedimientos de ensayo recomendados • Colorante VPD450 (1 mg/vial, almacenar desecado a ≤ -20 °C) Materiales necesarios pero no proporcionados • Suspensiones viables de células individuales de células linfoides primarias de interés • Dimetilsulfóxido (DMSO; p. ej., Sigma D2650) de grado de cultivo celular fresco • Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco estéril (1× PBS) • Medio de cultivo celular, p. ej., con suero fetal bovino (FBS) al 10 % • Tubos cónicos de polipropileno estériles de 15 ml (BD Falcon™ 352097) o 50 ml (BD Falcon™ 352098) • Tubos de microcentrífuga o crioviales de 2 ml • Anticuerpos fluorescentes para análisis inmunofenotípico o funcional (opcional) Equipo necesario • BD equipado con láser violeta Citómetro de flujo FACSCanto™ II, BD LSRFortessa™ o BD™ LSR II • Centrífuga • Incubadora de CO2 a 37 °C y baño de agua a 37 °C Procedimiento VPD450 tiene una absorción máxima de 410 nm y una emisión máxima de 450 nm. Antes de teñir con este reactivo, confirme que su citómetro de flujo es capaz de excitar el fluorocromo y discriminar la fluorescencia resultante. Preparación de la solución de colorante VPD450 en DMSO 1. Prepare una solución madre 1 mM de colorante VPD450: • Añada 1,0 mL de DMSO al vial de VPD450. Mezcle bien mediante vórtex. • Transfiera el colorante disuelto a un tubo cónico de 15 mL (o cualquier tubo que admita hasta 3 mL de volumen). • Añada 1,63 mL de DMSO y vuelva a mezclar bien para asegurarse de que el colorante se disuelva por completo. 2. Prepare alícuotas de un solo uso de la solución madre de VPD450 (volumen definido por el usuario) utilizando tubos de microcentrífuga etiquetados adecuadamente o crioviales de 2 ml (la etiqueta debe incluir el nombre del colorante, la concentración y la fecha). 3. Congele todas las alícuotas a -80 °C, protegidas de la luz. Nota: La solución madre de VPD450 se puede almacenar a -80 °C hasta por 6 meses. Las alícuotas se pueden descongelar y volver a congelar hasta dos veces sin reducir significativamente las intensidades de fluorescencia de las muestras de células marcadas con VPD450. Marcaje de células con VPD450 Este procedimiento se ha optimizado para marcar linfocitos de ratón y humanos a concentraciones celulares de 10-30 X 10^6/ml. Si se marcan menos células, siga el paso 6 a continuación (es decir, agregue 1 µL de VPD450 por 1 ml de suspensión celular). 1. Descongele la solución madre 1 mM de VPD450, si se congeló previamente. 2. Transfiera las suspensiones celulares a tubos de centrífuga de polipropileno de 15 o 50 mL. Nota: Evite usar recipientes de plástico de poliestireno ya que el tinte se unirá al plástico. 3. Lave las células en PBS 1× para eliminar cualquier proteína sérica residual. 4. Repita el paso 3. 5. Resuspenda las células completamente en una suspensión celular única a una concentración de 10-30 X 10^6/mL en PBS 1×. 6. Agregue 1 μL de solución madre 1 mM de VPD450 por cada 1 mL de suspensión celular para una concentración final de VPD450 de 1 μM. 7. Incube la suspensión de células y tinte en un baño de agua a 37 °C durante 10-15 minutos. 8. Agregue 9 veces el volumen original de PBS 1× a las células y sedimente las células por centrifugación. 9. Decante el sobrenadante y mezcle suavemente para romper el pellet celular. 10. Agregue 10 mL de medio completo con 10% FBS y repita el paso de centrifugación. 11. Decante el sobrenadante y mezcle suavemente para romper el pellet celular. 12. Resuspenda las células en medio completo y proceda al cultivo celular o análisis por citometría de flujo. Notas: • Confirme el brillo del marcaje celular comparando las células marcadas con células de control sin marcar. • Inmediatamente después del marcaje con VPD450, las células pueden exhibir fluorescencia en otros canales, especialmente el canal verde (p. ej., BD Horizon™ V500, AmCyan), cuando se excitan con el láser violeta. Sin embargo, esta fluorescencia regresa a los niveles normales después de 24 horas. • VPD450 se puede usar en ensayos de tinción intracelular que requieren fijación con formaldehído y permeabilización con metanol y detergentes como los que se usan para la tinción con BD Phosflow™ o la tinción de citocinas intracelulares. Se pueden lograr mayores intensidades de tinción inicial aumentando la concentración inicial de colorante VPD450. Sin embargo, al igual que con otros colorantes de rastreo que contienen ésteres succinimidílicos, concentraciones más altas pueden provocar mayor toxicidad celular o muerte celular.
Avisos del producto: Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Para conocer los espectros de fluorocromos y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web de citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. Cy es una marca registrada de GE Healthcare. Antes de teñir con este reactivo, confirme que su citómetro de flujo sea capaz de excitar el fluorocromo y discriminar la fluorescencia resultante. Consulte los protocolos técnicos en www.bdbiosciences.com/us/s/resources.