BD, 562247, Tinción de viabilidad reparable BD Horizon™ 450

Aplicación: Citometría de flujo, tinción intracelular (citometría de flujo) (probado durante el desarrollo)
ID de registro: AB_2869405
Estado regulatorio: RUO
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Preparación Lleve el polvo de colorante FVS450 y 400 μl de dimetilsulfóxido (DMSO; p. ej., Sigma D2650) fresco de grado de cultivo celular a temperatura ambiente. Agregue 400 μl de DMSO y agite bien la solución. Inspeccione la solución y repita el agitado hasta que el colorante madre se haya disuelto completamente. Almacenamiento Al llegar, almacene el colorante seco a -80 °C hasta su uso. Después de la reconstitución con DMSO, almacene la solución a -20 °C. La solución de colorante se puede usar hasta para cuatro ciclos de congelación y descongelación. Se pueden hacer alícuotas (p. ej., alícuotas de ~100 μl) y almacenar a -20 °C cuando sea necesario para experimentos más pequeños. No use el colorante reconstituido después de 40 días de almacenamiento. Deseche la solución de colorante después de 40 días de la reconstitución con DMSO. Requisitos de citometría: Se pueden utilizar citómetros de flujo con láser violeta (p. ej., BD FACSCanto™ II, BD LSRFortessa™ o BD™ LSR II). La compensación de la fluorescencia se consigue mejor con el juego de partículas de compensación BD™ CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (FBS) (n.º de cat. 552843) teñido con anticuerpos anti-CD3, CD4 o CD19 humanos de ratón BD Horizon™ V450. Como alternativa, se puede utilizar el juego de partículas de compensación BD™ CompBeads Anti-Rat Ig, κ/Negative Control (FBS) (n.º de cat. 552844) teñido con anticuerpos anti-CD3, CD4 o CD19 de rata BD Horizon™ V450. Procedimiento Marcaje de células con Fixable Viability Stain 450 1. Prepare las células para la tinción de citometría de flujo utilizando tampones sin azida sódica. 2. Lave las células una vez en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (1X DPBS) sin azida sódica ni proteínas. 3. Resuspenda las células a ~1-10 x 10^6 células/ml en 1X DPBS sin azida sódica ni proteínas. 4. Añada 1 μl de la solución madre Fixable Viability Stain 450 por cada 1 ml de suspensión celular y agite inmediatamente con vórtex. 5. Incube la mezcla durante 10-15 minutos a temperatura ambiente protegida de la luz. Opcional: incube las células y las mezclas de colorantes a 2-8 °C durante 20-30 minutos (puede ser más conveniente en aplicaciones de células de ratón). Como alternativa, incubar las mezclas a 37 °C durante 5-7 minutos (p. ej., para aplicaciones de BD Phosflow™). 6. Lavar las células una o dos veces con 2 ml de tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS) (n.º de cat. 554656) o equivalente. 7. Decante el sobrenadante y mezcle suavemente para romper el sedimento celular. 8. Resuspender las células en tampón de tinción (FBS) o equivalente. 9. Teñir, fijar y permeabilizar las células como se desee para aplicaciones posteriores. Notas: • La reactividad del colorante libre se inhibe lavando con tampón que contiene proteína (p. ej., FBS o BSA) antes de teñir con anticuerpos fluorescentes. El colorante de viabilidad fijable 450 se puede utilizar en ensayos de tinción intracelular que requieren fijación con formaldehído y permeabilización con metanol y detergentes, como los utilizados para la tinción con BD Phosflow™ (p. ej., n.° de cat. 558050, tampón de permeabilidad BD Phosflow™ III) o la tinción intracelular de citocinas (p. ej., n.° de cat. 554714, kit de fijación/permeabilización BD Cytofix/Cytoperm™). Las células pueden teñirse en bloque antes de congelarlas o teñirlas con anticuerpos fluorescentes. Cada usuario debe determinar las concentraciones óptimas de reactivos y células, así como las condiciones para el ensayo de interés.
Avisos del producto: Avisos del producto Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Para los espectros de fluorocromos y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web de citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. BD Horizon V450 tiene una absorción máxima de 406 nm y una emisión máxima de 450 nm. Antes de teñir con este reactivo, confirme que su citómetro de flujo sea capaz de excitar el fluorocromo y discriminar la fluorescencia resultante. Alexa Fluor® es una marca registrada de Molecular Probes, Inc., Eugene, OR. Cy es una marca registrada de GE Healthcare. Antes de teñir con este reactivo, confirme que su citómetro de flujo sea capaz de excitar el fluorocromo y discriminar la fluorescencia resultante. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para obtener los protocolos técnicos.