BD, 562496, Kit de análisis de endodermo pancreático y definitivo humano BD Stemflow™

Reactividad: Humana (Pruebas de control de calidad)
Aplicación: Tinción intracelular (citometría de flujo) (Probado rutinariamente)
Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2869421
Descripción: El kit BD Stemflow™ para análisis de endodermo pancreático y definitivo humano contiene una combinación de conjugados de anticuerpos monoclonales de ratón para el análisis de cultivos de diferenciación endodérmica pancreática y definitiva. Las especificidades de los anticuerpos que proporciona este kit y las poblaciones celulares que pueden identificar se enumeran en la tabla a continuación. Los componentes de anticuerpos de este kit pueden usarse individualmente o en combinaciones de hasta cuatro. Hay formatos de anticuerpos adicionales que permiten paneles más complejos disponibles en www.bdbiosciences.com. El kit también incluye el tampón de fijación BD Cytofix™ y el tampón de permeación BD Phosflow™ III. Componentes del kit: Componente Descripción Tamaño Vol. Tampón de almacenamiento por prueba 51-9008006 Alexa Fluor® 488 Anti-Pax-6 humano de ratón 25 Prueba 5 µl Solución tampón acuosa que contiene BSA y ≤0,09 % de azida sódica 51-9008007 PE Anti-PDX-1 de ratón 25 Prueba 5 µl Solución tampón acuosa que contiene BSA y ≤0,09 % de azida sódica 51-9008008 PE Anti-FoxA2 humano de ratón 25 Prueba 5 µl Solución tampón acuosa que contiene BSA y ≤0,09 % de azida sódica 51-9007227 PerCP-Cy™5.5 Anti-Sox2 de ratón 25 Prueba 5 µl Solución tampón acuosa que contiene BSA y ≤0,09 % de azida sódica 51-9008009 PerCP-Cy™5.5 Ratón antihumano Sox17 25 Prueba 5 µl Solución tampón acuosa que contiene BSA y ≤0,09 % de azida sódica 51-9008010 Alexa Fluor® 647 Ratón antihumano Nanog 25 Prueba 5 µl Solución tampón acuosa que contiene BSA y ≤0,09 % de azida sódica 51-9006607 Tampón Perm III 50 ml 51-9006276 Tampón de fijación 50 ml Especificidad Clon Población celular identificada Nanog N31-335 Células madre pluripotentes Sox2 O30-678 Células madre pluripotentes, contaminantes ectodérmicos Sox17 P7-969 Endodermo definitivo FoxA2 N17-280 Endodermo definitivo Pax6 O30-1330 Pancreático endodermo, contaminantes ectodérmicos Pdx1 658A5 Endodermo pancreático
Preparación y almacenamiento: Preparación y almacenamiento Almacenar sin diluir a 4 °C y protegido de la exposición prolongada a la luz. No congelar. El anticuerpo se conjugó con R-PE en condiciones óptimas y se eliminaron el anticuerpo no conjugado y el PE libre. El anticuerpo se conjugó con Alexa Fluor® 488 en condiciones óptimas y se eliminó el Alexa Fluor® 488 que no reaccionó. El anticuerpo se conjugó con PerCP-Cy5.5 en condiciones óptimas y se eliminaron el anticuerpo no conjugado y el PerCP-Cy5.5 libre. No se recomienda el almacenamiento de conjugados de PerCP-Cy5.5 en un diluyente no optimizado, ya que puede provocar la pérdida de intensidad de la señal. El anticuerpo se conjugó con FITC en condiciones óptimas y se eliminó el FITC que no reaccionó. El anticuerpo se conjugó con Alexa Fluor® 647 en condiciones óptimas y se eliminó el Alexa Fluor® 647 que no reaccionó.
Procedimientos de ensayo recomendados: 1. Separe las células de interés de la placa de cultivo. Se recomienda a los investigadores separar las células a 37 °C con la solución de desprendimiento celular Accutase™ (n.° de cat. 561527). Se recomienda triturar la suspensión celular de leve a moderadamente para obtener una suspensión celular única. 2. Lave las células en PBS 1X. Si se forman grumos, filtre las células con un filtro celular Falcon® de 70 mm (Corning, n.° de cat. 352350). 3. Resuspenda las células en tampón de fijación BD Cytofix™ 0,5X (n.° de cat. 554655) diluido en PBS 1X e incube a 37 °C durante 10 minutos. El volumen recomendado para la fijación celular es de 1 ml de solución de fijación por cada 10 millones de células, con un volumen mínimo de 200 μl. 4. Lave las células dos veces con PBS 1X. Si desea continuar más tarde, puede congelarlas y almacenarlas en una solución de DMSO al 10 % + FBS al 90 % a -80 °C, utilizando los métodos estándar para la criopreservación de células vivas. 5. Agite en vórtex para desprendimiento del sedimento celular y, a continuación, permebilice las células añadiendo lentamente BD Phosflow™ Perm Buffer III (n.º de cat. 558050) helado mientras agita. El volumen recomendado para permeabilizar las células es de 1 ml de BD Phosflow™ Perm Buffer III por cada 10 millones de células, con un volumen mínimo de 1 ml. 6. Incube en hielo durante 30 minutos o, alternativamente, conserve las células en BD Phosflow Perm Buffer III hasta 6 meses a -20 °C. 7. Lave las células dos veces con tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS) (n.° de cat. 554656) y resuspéndalas a una concentración de 5 a 10 millones de células/ml en tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS). Alternativamente, puede usar solución de lavado/tinción 1X (1 x PBS, 1 % FCS y 0,09 % de azida sódica). 8. Añada 100 μl de células a 12 tubos de poliestireno de 75 mm debidamente etiquetados. 9. Añada el panel de conjugados de anticuerpos que desee utilizar (5 μl/prueba de cada conjugado de anticuerpos) e incube en oscuridad durante 30 minutos. 10. Lave dos veces con 2 ml de tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS). 11. Resuspenda la muestra en un volumen adecuado (350-400 μL) de tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS) para analizarla en un citómetro de flujo. Consideraciones del kit: Elección de la enzima de desprendimiento celular: Se recomienda a los investigadores utilizar la solución de desprendimiento celular Accutase™ (n.° de cat. 561527), ya que se ha observado que la muerte celular con este método de desprendimiento es mínima. Métodos de fijación y permeabilización: Todos los componentes de este kit son compatibles entre sí. Sin embargo, si se incluyen especificidades adicionales, se debe verificar que esos conjugados de anticuerpos funcionen con los tampones de fijación/permeabilización incluidos en este kit. Adición de marcadores de superficie celular: CD184 PE (n.° de cat. 555974), CD184 APC (n.° de cat. 555976) y CD184 BV421 (n.° de cat. 562448) se han utilizado con éxito con los componentes de este kit. Sin embargo, como se observa una tinción de fondo inespecífica en células madre pluripotentes fijadas y teñidas con CD184, se recomienda separar las células, teñirlas en vivo con CD184, fijarlas como se recomienda anteriormente, permeabilizarlas con Triton™ X-100 al 0,1 % (Perm III puede afectar negativamente la tinción positiva para CD184) y, a continuación, teñirlas para marcadores intracelulares. Configuración del instrumento: Las partículas BD™ CompBead Plus (n.º de cat. 560497) pueden ser útiles para configurar el experimento en un citómetro de flujo. Se recomienda a los investigadores configurar los voltajes de PMT con las partículas BD™ CompBead Plus y comprobar que los ajustes de voltaje sean adecuados analizando una muestra de células teñidas antes de ejecutar todo el experimento. Análisis de datos: Se recomienda un enfoque de selección de grupos al analizar los datos. Poblaciones celulares: Este kit se ha desarrollado para su uso en poblaciones de células endodérmicas derivadas de células madre pluripotentes humanas mediante los métodos descritos en las leyendas de las figuras a continuación. Este kit no se ha probado en otros tipos de células, incluidas las células primarias, y los resultados pueden diferir al examinar tipos de células de un origen diferente (p. ej., tinción de fondo más alta). En estos casos, los investigadores pueden encontrar útil usar controles de isotipo para distinguir la tinción de fondo no específica de la tinción de anticuerpos específicos. Advertencias y precauciones Peligro: BD Phosflow™ Perm Buffer III (componente 51-9006607) contiene 87,68 % de metanol (p/p). Indicaciones de peligro Líquido y vapores altamente inflamables. Tóxico si se ingiere, en contacto con la piel o si se inhala. Provoca daños en el sistema nervioso central. Vía de exposición: Oral. Declaraciones de precaución Mantener alejado del calor/chispas/llamas abiertas/superficies calientes. - No fumar. Usar ropa protectora/protección ocular. Usar guantes protectores. No respirar la niebla/los vapores/el aerosol. EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL (o el pelo): Quítese inmediatamente toda la ropa contaminada. Enjuague la piel con agua/dúchese. EN CASO DE INHALACIÓN: Transportar a la víctima al exterior y mantenerla en reposo en una posición confortable para respirar. Peligro: El tampón de fijación BD Cytofix™ (componente 51-9006276) contiene 4,2 % de formaldehído (p/p). Indicaciones de peligro Nocivo si se inhala. Provoca irritación cutánea. Provoca lesiones oculares graves. Puede provocar una reacción alérgica en la piel. Se sospecha que provoca defectos genéticos. Puede provocar cáncer. Vía de exposición: Inhalatorio. Puede causar irritación respiratoria. Consejos de precaución Llevar ropa protectora / protección ocular. Llevar guantes de protección. No respirar la niebla/los vapores/el aerosol. EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Aclarar cuidadosamente con agua durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto, si lleva y resulta fácil. Seguir aclarando. En caso de irritación o sarpullido en la piel: Consultar a un médico.
Avisos del producto: Avisos del producto Tenga en cuenta las siguientes precauciones: La absorción de luz visible puede alterar significativamente la transferencia de energía que ocurre en cualquier conjugado de fluorocromo en tándem; por lo tanto, recomendamos tomar precauciones especiales (como envolver viales, tubos o gradillas en papel de aluminio) para evitar la exposición de los reactivos conjugados, incluidas las células teñidas con esos reactivos, a la iluminación ambiental. La emisión del fluorocromo Alexa Fluor® 488 se recoge con la misma configuración del instrumento que para el isotiocianato de fluoresceína (FITC). Los anticuerpos marcados con PerCP-Cy5.5 se pueden usar con reactivos marcados con FITC y R-PE en citómetros de flujo de láser único sin superposición espectral significativa de la fluorescencia de PerCP-Cy5.5, FITC y R-PE. PerCP-Cy5.5 está optimizado para su uso con un solo láser de iones de argón que emite luz de 488 nm. Debido al amplio espectro de absorción del fluorocromo en tándem, se debe tener especial cuidado al utilizar citómetros de doble láser, ya que pueden excitar directamente tanto PerCP como Cy5.5™. Recomendamos el uso de compensación de haz cruzado durante la adquisición de datos o compensación de software durante el análisis de datos. La emisión del fluorocromo Alexa Fluor® 647 se recopila con la misma configuración del instrumento que para la aloficocianina (APC). Accutase es una marca registrada de Innovative Cell Technologies, Inc. Alexa Fluor® es una marca registrada de Molecular Probes, Inc., Eugene, OR. Los conjugados de anticuerpos de los colorantes Alexa Fluor®, Pacific Blue™ y Cascade Blue® de este producto se venden bajo licencia de Molecular Probes, Inc. exclusivamente para uso en investigación, excluyendo su uso en combinación con microarrays o como reactivos específicos para analitos. Los colorantes Alexa Fluor® (excepto Alexa Fluor® 430), Pacific Blue™ y Cascade Blue® están cubiertos por patentes en trámite y concedidas. Este producto conjugado con PerCP se vende bajo la licencia de la siguiente patente: Patente estadounidense n.º 4.876.190. Cy es una marca registrada de Amersham Biosciences Limited. Este producto conjugado se vende bajo la licencia de las siguientes patentes: Patentes estadounidenses n.º 5.486.616; 5.569.587; 5.569.766; 5.627.027. Este producto está sujeto a los derechos de propiedad de Amersham Biosciences Corp. y la Universidad Carnegie Mellon, y se fabrica y vende bajo la licencia de Amersham Biosciences Corp. Este producto tiene licencia de venta únicamente para investigación. No tiene licencia para ningún otro uso. Si necesita una licencia comercial para usar este producto y no la tiene, devuelva este material, sin abrir, a BD Biosciences, 10975 Torreyana Rd, San Diego, CA 92121 y se le reembolsará el importe pagado por el material. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA, ubicados en Estados Unidos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Para obtener información sobre los espectros de fluorocromos y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web sobre citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. Para obtener información sobre los protocolos técnicos, consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources.