BD, 562574, Conjunto de tampones de factores de transcripción BD Pharmingen™

Aplicación: Tinción intracelular (citometría de flujo) (Probado rutinariamente)
Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2869424
Descripción: El set de tampones para factores de transcripción BD Pharmingen™ está optimizado para la fijación y permeabilización de células antes de la tinción inmunofluorescente y el análisis por citometría de flujo de células que expresan proteínas intracitoplasmáticas e intranucleares específicas. El set de tampones para factores de transcripción BD Pharmingen™ fue diseñado para mejorar la facilidad de uso y minimizar el tiempo de procesamiento, reducir la tinción inespecífica, aumentar la resolución de las células teñidas positivamente y reducir significativamente la pérdida celular durante los procedimientos de fijación, permeabilización y tinción. La detección por citometría de flujo de las numerosas proteínas que se sabe que se expresan en diversos compartimentos intracelulares, especialmente los factores de transcripción, se mejora con el uso del set de tampones para factores de transcripción BD Pharmingen™. Este sistema de tampón ha demostrado ser útil para la fijación y permeabilización de diversos tipos de células de diversos tejidos humanos y murinos. El sistema de tampón es flexible para soportar análisis de muestras a granel y de alto rendimiento en placas multipocillo y aplicaciones que requieren almacenamiento de muestras durante la noche. El sistema tampón tiene un impacto mínimo en las características de dispersión de luz y autofluorescencia de las células procesadas, lo que resulta en características similares a las observadas en células primarias recién preparadas y altamente viables. En muchos casos, el sistema tampón resultó compatible con la tinción inmunofluorescente de antígenos de superficie celular, tanto antes como después de la fijación celular y la permeabilización. El sistema tampón también es compatible con numerosos fluorocromos en tándem.
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C. Mantener los tampones madre y las soluciones de trabajo 1x a 2-8 °C. Tras abrir el set de tampones de factor de transcripción BD Pharmingen™, utilizarlo en un plazo de seis meses. Si se conserva sin abrir, utilizar antes de la fecha de caducidad indicada en las etiquetas de los frascos. Evitar la contaminación microbiana de los reactivos, ya que pueden producirse resultados incorrectos. Manipule el tampón diluyente TF (componente 51-9008101) en una cabina estéril o utilice prácticas asépticas para preservar la integridad de la solución.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Antes de la tinción intracelular • Prepare suspensiones de células individuales de tejidos linfoides de interés (p. ej., sangre periférica humana, timo de ratón o ganglio linfático). Etiquete tubos de poliestireno de 5 ml de fondo redondo de 12 × 75 mm e identifique los anticuerpos apropiados para su experimento. • Invierta lentamente las botellas de tampón de fijación/permanencia TF BD Pharmingen™ (4X), tampón diluyente TF y tampón de lavado/permanencia TF (5X) 5 veces antes de preparar las soluciones de trabajo. • Diluya el tampón de fijación/permanencia 4x utilizando el tampón diluyente TF hasta el volumen necesario de solución de trabajo de fijación/permanencia 1x (una dilución típica para 20 pruebas es de 5 ml de tampón de fijación/permanencia 4x y 15 ml de tampón diluyente TF). Utilice la solución de trabajo de tampón de fijación/permanencia 1x para el protocolo de tinción intracelular que se indica a continuación en el plazo de 1 hora desde la preparación. • Diluya el tampón de permanente/lavado 5x en una solución de trabajo de tampón de permanente/lavado 1x. (Una dilución típica para 20 pruebas sería añadir 30 ml de tampón de permanente/lavado 5x a 120 ml de agua desionizada para obtener 150 ml de tampón de permanente/lavado 1x). Utilice la solución de trabajo de tampón de permanente/lavado 1x para el protocolo de tinción intracelular que se indica a continuación. Conserve el tampón de permanente/lavado 1x a 2-8 °C durante un máximo de 1 semana. • Los tampones para tinción intracelular deben conservarse en hielo o a 2-8 °C durante todo el protocolo de tinción intracelular. Tinción de superficie: Prepare una suspensión celular con 10^e6 células por ml en tampón de tinción para citometría de flujo, como BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS) (n.° de cat. 554656) o Stain Buffer (BSA) (n.° de cat. 554657). Incube 100 µl de células por tubo con anticuerpos fluorescentes (p. ej., anticuerpos específicos para CD4, CD8, CD25, CD19) durante 30 minutos a 2-8 °C. Lave una vez con 2 ml de tampón de tinción y centrifugue las células a 350 g durante 5 minutos antes de comenzar el protocolo de tinción intracelular que se indica a continuación. Protocolo de tinción intracelular 1. Fijación/Permanencia: Una vez finalizado el procedimiento de tinción de la superficie celular, aspire el tampón de tinción residual y desprenda el sedimento celular mediante una breve agitación en vórtex. Añadir 1 ml de solución de trabajo de tampón de fijación/permanencia 1x recién preparada a cada tubo y resuspender los sedimentos celulares mediante agitación vorticial durante aproximadamente 3 segundos. Incube las muestras a 2-8 °C durante 40-50 minutos protegidas de la luz. 2. Permanencia/lavado: Añadir 1 ml de tampón de fijación/lavado 1x directamente a las células fijadas y permeabilizadas suspendidas en el tampón de fijación/permanencia 1x. Sedimentar las células mediante centrifugación. (Nota: Todos los pasos de centrifugación posteriores a la fijación/permanencia se realizan a 350 g y a 2-8 °C durante 6 minutos). Decantar o aspirar los sobrenadantes. 3. Permanencia/lavado: Añadir 2 ml de tampón de fijación/lavado 1x a las células sedimentadas y, a continuación, centrifugar. Decantar o aspirar el tampón de lavado. 4. Tinción intracelular: añadir 80-100 µl de tampón de permanente/lavado 1x a las muestras celulares y los anticuerpos fluorescentes específicos para proteínas intracelulares (p. ej., FoxP3, T-bet o IL-17A) y para tinción de control no específica (p. ej., controles de isotipo de Ig fluorescente coincidentes) a cada tubo. Agitar en vórtex el tubo o la gradilla durante 10 segundos e incubar a 2-8 °C durante 40-50 minutos protegido de la luz. 5. Permanente/lavado: agitar brevemente las muestras antes del lavado. Lavar las células con 2 ml de tampón de permanente/lavado 1x. Centrifugar las células. Decantar o aspirar el tampón de lavado. 6. Permanente/lavado: lavar las células con 2 ml de 1x Permanente/lavado. Centrifugar las células. Decantar o aspirar el tampón de lavado. 7. Preparación de la muestra para citometría de flujo: resuspender el sedimento celular en 350 µl de tampón de tinción para citometría de flujo. Analice las células y adquiera datos utilizando un citómetro de flujo. Notas: • Debido al procedimiento de fijación y permeabilización, las señales de dispersión de luz frontal y lateral serán ligeramente diferentes a las de las células vivas. • El sistema de tampón está optimizado para su uso con ajustes de fluorescencia establecidos mediante el kit de configuración y seguimiento de perlas BD™ Cytometer (n.º de cat. 642412). Sin embargo, para su aplicación, es posible que se deban realizar pequeños ajustes en el voltaje de la puerta o del detector antes de la compensación y la adquisición. • Orientar la adquisición a un número estadísticamente significativo de eventos. • Es posible que su aplicación requiera una titulación de la cantidad de tinción óptima del anticuerpo fluorescente y una optimización del tiempo de tinción. Peligro: TF Fix/Perm Buffer (4X) (componente 51-9008100) contiene 5,3 % de formaldehído y 1,88 % de metanol. Indicaciones de peligro: Nocivo si se ingiere. Provoca irritación cutánea. Puede provocar una reacción alérgica en la piel. Provoca lesiones oculares graves. Se sospecha que causa defectos genéticos. Puede provocar cáncer. Puede causar irritación respiratoria. Nocivo para los organismos acuáticos. Consejos de precaución: Lávese bien después de manipular este producto. No coma, beba ni fume mientras lo utilice. Use guantes, ropa, gafas y máscara de protección. Evite respirar polvo, humo, gas, niebla, vapores o aerosoles. La ropa de trabajo contaminada no debe salir del lugar de trabajo. Obtenga instrucciones especiales antes de usar. No lo manipule hasta haber leído y comprendido todas las precauciones de seguridad. Use el equipo de protección personal necesario. Úselo solo en exteriores o en un área bien ventilada. Evite su liberación al medio ambiente.
Avisos del producto: Alexa Fluor® es una marca registrada de Molecular Probes, Inc., Eugene, OR. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Cy es una marca registrada de GE Healthcare. Consulte http://regdocs.bd.com para acceder a las fichas de datos de seguridad (FDS). Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos.
Descripción: Cantidad/Tamaño: Número de pieza: ID de EntrezGene
N/D : 150.0 : N/D : N/D