BD, 562626, Kit de análisis y clasificación de células madre pluripotentes inducidas humanas BD Stemflow™

Reactividad: Humana (Pruebas de control de calidad)
Aplicación: Citometría de flujo (probada rutinariamente)
Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2869428
Descripción: El kit de clasificación y análisis de iPSC humanas BD Stemflow™ contiene una combinación de conjugados de anticuerpos monoclonales de ratón para la clasificación y el análisis de cultivos de células madre pluripotentes humanas inducidas (hiPSC) y células en proceso de reprogramación. Siguiendo los protocolos de reprogramación establecidos, las hiPSC se clasifican o analizan a partir de un cultivo celular heterogéneo utilizando los conjugados de anticuerpos incluidos con tres marcadores de superficie celular. Las especificidades de los anticuerpos que se proporcionan en este kit y las poblaciones celulares que pueden identificar se enumeran en la tabla a continuación. El kit también incluye controles de isotipo y BD™ CompBead Plus. Hay formatos de anticuerpos adicionales que pueden permitir paneles más complejos disponibles en www.bdbiosciences.com. Componentes del kit Componente Descripción Tamaño Vol. Tampón de almacenamiento por prueba 51-9008175 PerCP-Cy™5.5 Anti-CD13 humano de ratón 50 pruebas 5 µl Solución tampón acuosa que contiene BSA y ≤0,09 % de azida sódica 51-9008176 Alexa Fluor® 647 Anti-SSEA-4 de ratón 50 pruebas 5 µl Solución tampón acuosa que contiene BSA y ≤0,09 % de azida sódica 51-9008177 PE Anti-antígeno TRA-1-60 humano de ratón 50 pruebas 5 µl Solución tampón acuosa que contiene estabilizador de proteínas, BSA y ≤0,09 % de azida sódica 51-9008178 PerCP-Cy™5.5 Control de isotipo IgG1, κ de ratón 50 pruebas 5 µl Solución tampón acuosa que contiene BSA y ≤0,09 % de azida sódica 51-9008179 Alexa Fluor® 647 IgG3 de ratón, control de isotipo κ 50 pruebas 5 µl Solución tampón acuosa que contiene BSA y ≤0,09 % de azida sódica 51-9008180 PE IgM de ratón, control de isotipo κ 50 pruebas 5 µl Solución tampón acuosa que contiene BSA y ≤0,09 % de azida sódica 51-9006227 Control negativo (PBS con 1 % de BSA) CompBead Plus 6 ml 1 gota Solución tampón acuosa que contiene BSA y ≤0,09 % de azida sódica 51-9006274 Anti-Ig de ratón, κ CompBead Plus 6 ml 1 gota Solución tampón acuosa que contiene BSA y ≤0,09 % de azida sódica azida Especificidad Clon Población celular identificada CD13 WM15 Fibroblastos, células que no están reprogramadas TRA-1-60 TRA-1-60.1 Células madre pluripotentes SSEA-4 MC-813-70.1 Células madre pluripotentes
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C y protegido de la luz. No congelar. El anticuerpo se conjugó con R-PE en condiciones óptimas y se eliminaron el anticuerpo no conjugado y el PE libre. El anticuerpo se conjugó con PerCP-Cy5.5 en condiciones óptimas y se eliminaron el anticuerpo no conjugado y el PerCP-Cy5.5 libre. No se recomienda almacenar conjugados de PerCP-Cy5.5 en un diluyente no optimizado, ya que puede provocar una pérdida de intensidad de la señal. El anticuerpo se conjugó con Alexa Fluor® 647 en condiciones óptimas y se eliminó el Alexa Fluor® 647 que no reaccionó.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Este panel se ha probado en fibroblastos de prepucio reprogramados en un sistema sin alimentador utilizando un cóctel de moléculas pequeñas, SMC4 (consulte Valamehr et al, 2012 para obtener más información). Utilizando el panel, las células se aislaron utilizando la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) en una etapa temprana, aproximadamente los días 20 posteriores a la transducción. Las células que se clasificaron en masa en esta etapa se cultivaron aún más. Aproximadamente 30 días después de la transducción, las células se clasificaron en masa y de forma individual. Como las células, los métodos de reprogramación y los cursos temporales pueden diferir, la clasificación específica, los tiempos de análisis y los resultados pueden variar. Instrucciones para el análisis celular (1) Separe las células de interés de la placa de cultivo. Se recomienda a los investigadores separar las células a 37 °C utilizando la solución de desprendimiento de células Accutase™ (n.º de cat. 561527). Se recomienda una trituración de leve a moderada de la suspensión celular para lograr una suspensión de una sola célula. (2) Utilice medio o 1XPBS para eliminar las células residuales de la placa. Si se observan grumos, las células pueden filtrarse con un filtro celular BD Falcon™ de 70 mm (n.° de cat. 352350). (3) Recoja las células y centrifugéelas. (4) Resuspenda de 5 a 10 millones de células/ml en tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS) (n.° de cat. 554656). Como alternativa, puede utilizar una solución con 1XPBS, 1 % de FCS y 0,09 % de azida sódica. (5) Etiquete los tubos y añada los conjugados de anticuerpos correspondientes como se describe a continuación. Agitar CompBead Plus en vórtex antes de usar: Tubo Etiqueta Añadir (1 prueba o gota) 1. Compensación sin etiquetar CompBead plus negativo + Compbead plus antirratón 2. Compensación PE CompBead plus negativo + Compbead plus antirratón + TRA-1-60 PE 3. Compensación PerCP-Cy™5.5 CompBead plus negativo + Compbead plus antirratón + CD13 PerCP-Cy™5.5 4. Compensación Alexa Fluor® 647 CompBead plus negativo + Compbead plus antirratón + SSEA-4 Alexa Fluor® 647 4. Células solas Nada 5. Control de isotipo Ms IgGM PE + Ms IgG1 PerCP-Cy5.5 + Ms IgG3 Alexa Fluor® 647 6. Muestra de análisis TRA-1-60 PE + CD13 PerCP-Cy5.5 + SSEA-4 Alexa Fluor® 647 (6) Añada 100 μl de células a tubos de poliestireno de 12 x 75 mm etiquetados adecuadamente. (7) Incube en oscuridad durante 30 minutos. (8) Lave dos veces con 2 ml de tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS). (9) Resuspenda la muestra en un volumen apropiado (350-400 μl) de tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS) para procesar en un citómetro de flujo. Instrucciones para la clasificación celular (todos los pasos se realizan mediante técnicas estériles) (1) Separe las células de interés de la placa de cultivo. Se recomienda a los investigadores separar las células a 37 °C utilizando la solución de desprendimiento de células Accutase™ (n.º de cat. 561527). Se recomienda una trituración de leve a moderada de la suspensión celular para lograr una suspensión de una sola célula. (2) Utilice medios para eliminar las células residuales de la placa. Si se observan grumos, las células se pueden filtrar con un filtro celular BD Falcon™ de 70 mm (n.° de cat. 352350). (3) Recolectar y centrifugar las células. (4) Resuspender las células a una concentración de aproximadamente 5-10 millones de células/ml en el tampón de separación adecuado. Para esta aplicación, utilizamos HBSS/4 % FBS/10 mM HEPES/1X Pen/Strep/10 µM Tiazovivina. (5) Utilizar tubos estériles de 12 x 75 mm con tapa. Etiquete los tubos y agregue los conjugados de anticuerpos correspondientes como se describe a continuación: Tubo Etiqueta Agregar (1 prueba o gota) 1. Compensación sin etiquetar CompBead plus negativo + Compbead plus antirratón 2. Compensación PE CompBead plus negativo + Compbead plus antirratón + TRA-1-60 PE 3. Compensación PerCP-Cy™5.5 CompBead plus negativo + Compbead plus antirratón + CD13 PerCP-Cy™5.5 4. Compensación Alexa Fluor® 647 CompBead plus negativo + Compbead plus antirratón + SSEA-4 Alexa Fluor® 647 4. Células solas Nada 5. Control de isotipo Ms IgGM PE + Ms IgG1 PerCP-Cy5.5 + Ms IgG3 Alexa Fluor® 647 6. Clasifique la muestra 2 pruebas (10 ul) de cada una de TRA-1-60 PE + CD13 PerCP-Cy5.5 + SSEA-4 Alexa Fluor® 647 (6) Agregue 50-100 ul de células a los tubos 4 y 5. (7) Agregue hasta 500 ul de células (5 millones de células) al tubo 6. (8) Si desea clasificar más de 5 millones de células, recomendamos replicar el tubo 6 con células adicionales que desee clasificar. (9) Incubar las células en hielo en la oscuridad durante 20-30 minutos. (10) Lavar las células una vez con 2 ml en el tampón de clasificación adecuado (tubos 4-6). Los tubos de compensación 1-4 se pueden lavar con PBS estéril 1X. (11) Resuspender las células en el tampón de clasificación adecuado (utilizamos HBSS/4%FBS/10 mM HEPES/1X Pen/Strep/10 uM Thiazovivin) a una concentración de 2,5 a 5 millones de células/ml. Alternativamente, comuníquese con el operador de su clasificador celular para obtener una concentración final sugerida de células para la clasificación. Consideraciones del kit: Elección de una enzima de desprendimiento celular: Se recomienda a los investigadores utilizar la solución de desprendimiento celular Accutase™ (n.º de cat. 561527), ya que se ha observado que la muerte celular con este método de desprendimiento es mínima. Consideraciones de clasificación celular activada por fluorescencia de células individuales y a granel: Utilizando el panel, las células se clasificaron a granel en las etapas de reprogramación temprana y tardía (aproximadamente los días 20 y 30 posteriores a la transducción) y las células individuales se clasificaron aproximadamente el día 30 posterior a la transducción. Para obtener detalles adicionales sobre el flujo de trabajo y el concepto de clasificación de células individuales de hiPSC, consulte Valamehr et al., 2012 para obtener más detalles. Para la clasificación de células individuales, se recomienda sembrar las células en placas de 96 pocillos con varios números de células (hemos tenido éxito con células sembradas a 1, 3 y 9 células por pocillo) ya que las eficiencias de siembra pueden variar. Tenga en cuenta que en células reprogramadas y cultivadas en medio SMC4, la fibronectina (n.° de cat. 356008) utilizada a 5 µg/ml puede ser beneficiosa tanto para la clasificación celular en masa como para la de células individuales si se mantiene en el medio aproximadamente 48 horas después de la clasificación. Además, si las células sembradas en placas de 96 pocillos necesitan cultivarse en la misma matriz durante más de una semana, se puede añadir fibronectina a 5 µg/ml para facilitar el mantenimiento de la adhesión celular. Análisis de datos: Se recomienda un enfoque de selección por grupos al analizar los datos.
Avisos del producto: Avisos del producto Tenga en cuenta las siguientes precauciones: La absorción de luz visible puede alterar significativamente la transferencia de energía que ocurre en cualquier conjugado de fluorocromo en tándem; por lo tanto, recomendamos tomar precauciones especiales (como envolver viales, tubos o gradillas en papel de aluminio) para evitar la exposición de los reactivos conjugados, incluidas las células teñidas con esos reactivos, a la iluminación ambiental. La emisión del fluorocromo Alexa Fluor® 647 se recoge con la misma configuración del instrumento que para la aloficocianina (APC). Alexa Fluor® es una marca registrada de Molecular Probes, Inc., Eugene, OR. Los conjugados de anticuerpos colorantes Alexa Fluor®, Pacific Blue™ y Cascade Blue® de este producto se venden bajo licencia de Molecular Probes, Inc. solo para uso en investigación, excluyendo el uso en combinación con microarrays o como reactivos específicos de analito. Los colorantes Alexa Fluor® (excepto Alexa Fluor® 430), Pacific Blue™ y Cascade Blue® están cubiertos por patentes pendientes y emitidas. Los anticuerpos marcados con PerCP-Cy5.5 pueden utilizarse con reactivos marcados con FITC y R-PE en citómetros de flujo de láser único sin superposición espectral significativa de la fluorescencia de PerCP-Cy5.5, FITC y R-PE. PerCP-Cy5.5 está optimizado para su uso con un láser de iones de argón que emite luz de 488 nm. Debido al amplio espectro de absorción del fluorocromo en tándem, se debe tener especial cuidado al utilizar citómetros de láser dual, ya que pueden excitar directamente tanto PerCP como Cy5.5™. Recomendamos el uso de compensación de haz cruzado durante la adquisición de datos o compensación de software durante el análisis de datos. Cy es una marca registrada de Amersham Biosciences Limited. Este producto conjugado se vende bajo licencia de las siguientes patentes: Patentes de EE. UU. n.º 5.486.616; 5.569.587; 5.569.766; 5.627.027. Este producto está sujeto a los derechos de propiedad de Amersham Biosciences Corp. y Carnegie Mellon University, y se fabrica y vende bajo licencia de Amersham Biosciences Corp. Este producto tiene licencia de venta solo para investigación. No tiene licencia para ningún otro uso. Si necesita una licencia comercial para usar este producto y no la tiene, devuelva este material sin abrir a BD Biosciences, 10975 Torreyana Rd, San Diego, CA 92121 y se le reembolsará el dinero pagado por el material. La fuente de todas las proteínas séricas proviene de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en los Estados Unidos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Para obtener información sobre los espectros de fluorocromos y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web sobre citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. Para conocer los protocolos técnicos, visite www.bdbiosciences.com/us/s/resources.