BD, 562725, Conjunto de tampones de factores de transcripción BD Pharmingen™

Aplicación: Tinción intracelular (citometría de flujo) (Probado rutinariamente)
Estado regulatorio: RUO
Descripción: El set de tampones para factores de transcripción BD Pharmingen™ está optimizado para la fijación y permeabilización de células antes de la tinción inmunofluorescente y el análisis por citometría de flujo de células que expresan proteínas intracitoplasmáticas e intranucleares específicas. El set de tampones para factores de transcripción BD Pharmingen™ fue diseñado para mejorar la facilidad de uso y minimizar el tiempo de procesamiento, reducir la tinción inespecífica, aumentar la resolución de las células teñidas positivamente y reducir significativamente la pérdida celular durante los procedimientos de fijación, permeabilización y tinción. La detección por citometría de flujo de las numerosas proteínas que se sabe que se expresan en diversos compartimentos intracelulares, especialmente los factores de transcripción, se mejora con el uso del set de tampones para factores de transcripción BD Pharmingen™. Este sistema de tampón ha demostrado ser útil para la fijación y permeabilización de diversos tipos de células de diversos tejidos humanos y murinos. El sistema de tampón es flexible para soportar análisis de muestras a granel y de alto rendimiento en placas multipocillo y aplicaciones que requieren almacenamiento de muestras durante la noche. El sistema tampón tiene un impacto mínimo en las características de dispersión de luz y autofluorescencia de las células procesadas, lo que resulta en características similares a las observadas en células primarias recién preparadas y altamente viables. En muchos casos, el sistema tampón resultó compatible con la tinción inmunofluorescente de antígenos de superficie celular, tanto antes como después de la fijación celular y la permeabilización. El sistema tampón también es compatible con numerosos fluorocromos en tándem.
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C. Mantener los tampones madre y las soluciones de trabajo 1x a 2-8 °C. Tras abrir el set de tampones de factor de transcripción BD Pharmingen™, utilizarlo en un plazo de seis meses. Si se conserva sin abrir, utilizar antes de la fecha de caducidad indicada en las etiquetas de los frascos. Evitar la contaminación microbiana de los reactivos, ya que pueden producirse resultados incorrectos. Manipule el tampón diluyente TF (componente 51-9008315) en una cabina estéril o utilice prácticas asépticas para preservar la integridad de la solución.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Antes de la tinción intracelular • Prepare suspensiones de células individuales de tejidos linfoides de interés (p. ej., sangre periférica humana, timo de ratón o ganglio linfático). Etiquete tubos de poliestireno de 5 ml de fondo redondo de 12 × 75 mm e identifique los anticuerpos apropiados para su experimento. • Invierta lentamente cinco veces las botellas de tampón fijador/permanente TF BD Pharmingen™ (4X), tampón diluyente TF y tampón de lavado/permanente TF (5X) antes de preparar las soluciones de trabajo. • Diluya el tampón fijador/permanente 4x utilizando el tampón diluyente TF al volumen necesario de solución de trabajo fijador/permanente 1x (una dilución típica para 20 pruebas es de 5 ml de fijador/permanente 4x y 15 ml de tampón diluyente TF). Utilice la solución de trabajo del tampón fijador/permanente 1x para el protocolo de tinción intracelular que se indica a continuación en el plazo de una hora desde la preparación. • Diluya el tampón de permanente/lavado 5x en una solución de trabajo de tampón de permanente/lavado 1x. (Una dilución típica para 20 pruebas sería 30 ml de tampón de permanente/lavado 5x añadidos a 120 ml de agua desionizada para obtener 150 ml de tampón de permanente/lavado 1x). Utilice la solución de trabajo de tampón de permanente/lavado 1x para el protocolo de tinción intracelular que se indica a continuación. Conserve el tampón de permanente/lavado 1x a 2-8 °C durante un máximo de una semana. • Los tampones para tinción intracelular deben mantenerse en hielo o a 2-8 °C durante todo el protocolo de tinción intracelular. • Tinción de superficie: Prepare una suspensión celular que contenga 10 millones de células por ml en tampón de tinción para citometría de flujo, como el tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS) (n.º de cat. 554656) o el tampón de tinción (BSA) (n.º de cat. 554657). Incubar 100 µl de células por tubo con anticuerpos fluorescentes (p. ej., anticuerpos específicos para CD4, CD8, CD25, CD19) durante 30 minutos a 2-8 °C. Lavar las células una vez con 2 ml de tampón de tinción y seguir adelante con el protocolo de tinción intracelular que se indica a continuación. Protocolo de tinción intracelular 1. Fijar/Permanecer: Una vez completado el procedimiento de tinción de la superficie celular, aspirar el tampón de tinción residual. Resuspender los pellets celulares mediante una breve agitación en vórtex y añadir 1 ml de solución de trabajo de tampón de fijación/permanencia 1x recién preparada a cada tubo. Agitar las muestras en vórtex durante aproximadamente tres segundos después de añadir el tampón de fijación/permanencia. Incubar las muestras a 2-8 °C durante 40-50 minutos protegidas de la luz. 2. Permanecer/Lavar: Añadir 1 ml de tampón de fijación/lavado 1x directamente a las células fijadas y permeabilizadas suspendidas en el tampón de fijación/permanencia 1x. Sedimentar las células mediante centrifugación. (Nota: Todos los pasos de centrifugación posteriores a la fijación/permanencia se realizan a 350 g y a 2-8 °C durante 6 minutos). Decantar o aspirar los sobrenadantes. 3. Permanencia/lavado: añadir 2 ml de tampón de permanencia/lavado 1x a las células sedimentadas seguido de centrifugación. Decantar o aspirar el tampón de lavado. 4. Tinción intracelular: añadir 80-100 µl de tampón de permanencia/lavado 1x a las muestras de células y los anticuerpos fluorescentes específicos para proteínas intracelulares (p. ej., FoxP3, T-bet o IL-17A) y para tinción de control no específica (p. ej., controles de isotipo de Ig fluorescente coincidentes) a cada tubo. Agitar el tubo o la gradilla durante 10 segundos e incubar a 2-8 °C durante 40-50 minutos protegido de la luz. 5. Permanencia/lavado: Agitar brevemente las muestras en vórtex antes de lavar. Lavar las células con 2 ml de tampón de permanencia/lavado 1x. Centrifugue las células. Decante o aspire el tampón de lavado. 6. Permeabilización/Lavado: Lave las células con 2 ml de Permeabilización/Lavado 1x. Centrifugue las células. Decante o aspire el tampón de lavado. 7. Preparación de la muestra para citometría de flujo: Resuspenda el sedimento celular en 350 µl de tampón de tinción para citometría de flujo. Analice las células y adquiera los datos con un citómetro de flujo. Notas: • Debido al procedimiento de fijación y permeabilización, las señales de dispersión de luz frontal y lateral serán ligeramente diferentes a las de las células vivas. • El sistema de tampón está optimizado para su uso con ajustes de fluorescencia establecidos mediante el kit de configuración y seguimiento de perlas BD™ Cytometer Setup & Tracking Beads (n.º de cat. 642412). Sin embargo, para su aplicación, es posible que deban realizarse pequeños ajustes en la puerta o el voltaje del detector antes de la compensación y la adquisición. • Encuentre la adquisición para un número estadísticamente significativo de eventos. • Es posible que su aplicación requiera una titulación de la cantidad óptima de tinción del anticuerpo fluorescente y la optimización del tiempo de tinción. Peligro: TF Fix/Perm Buffer (4X) (Componente 51-9008314) contiene 5,0 % de formaldehído (p/p) y 1,76 % de metanol (p/p). Indicaciones de peligro: Nocivo en caso de ingestión o contacto con la piel. Tóxico en caso de inhalación. Provoca irritación cutánea. Provoca lesiones oculares graves. Puede provocar una reacción alérgica en la piel. Se sospecha que provoca defectos genéticos. Puede provocar cáncer. Vía de exposición: Inhalatorio. Puede causar irritación respiratoria. Consejos de precaución: Llevar ropa protectora/protección ocular. Llevar guantes protectores. Evitar respirar la niebla/los vapores/el aerosol. EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Aclarar cuidadosamente con agua durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto, si lleva y resulta fácil. Seguir aclarando. EN CASO DE INHALACIÓN: Transportar a la víctima al exterior y mantenerla en reposo en una posición confortable para respirar. EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL: Lavar con abundante agua. Precaución: El tampón de permanente/lavado TF (5X) (Componente 51-9008316) contiene ≤ 0,09 % de azida sódica. La azida sódica produce azida hidrazoica, altamente tóxica en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías.
Avisos del producto: Cy es una marca registrada de Amersham Biosciences Limited. Alexa Fluor® es una marca registrada de Molecular Probes, Inc., Eugene, OR. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos.
Descripción: Cantidad/Tamaño: Número de pieza: ID de EntrezGene
N/D : 40.0 : N/D : N/D