BD, 563794, Tampón de tinción brillante BD Horizon™

Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C y protegido de la luz. No congelar.
Procedimientos de ensayo recomendados: Protocolos de procedimientos de ensayo recomendados para tinción inmunofluorescente multicolor de células utilizando el tampón de tinción brillante BD Horizon Tinción multicolor de muestras de células humanas en tubos o placas de 96 pocillos utilizando reactivos de tinción individuales 1. Agregue 50 μL de tampón de tinción brillante BD Horizon a todos los tubos o pocillos deseados para el experimento Nota: La cantidad de 50 μL de tampón de tinción brillante por tubo o por pocillo no depende del volumen de tinción final ni de la cantidad de células utilizadas por tubo ni del número de anticuerpos fluorescentes BD utilizados en la tinción. Aunque escritos para su uso con células humanas, estos protocolos se pueden adaptar fácilmente para analizar células de ratón o células de otras especies, por ejemplo, tiñendo células de ratón a 4 °C en lugar de a temperatura ambiente (TA). 2. Agregue cada reactivo fluorescente al volumen recomendado por prueba (p. ej., 5 μL o 20 μL) y luego proceda al Protocolo 1, 2 o 3. Protocolo 1 para teñir muestras de sangre completa en tubos a. Agregue 100 μL de sangre completa humana a cada tubo b. Agite el contenido del tubo c. Incube (30 min) las células suspendidas protegidas de la luz a temperatura ambiente (TA) d. Agregue 2 mL de solución de lisis BD FACS™ (n.º de cat. 349202; 10 min) o tampón de lisis BD Pharm Lyse™ (n.º de cat. 555899; 15 min) por tubo e incube protegido de la luz a TA e. Sedimente las células por centrifugación (5 min) a 1400-1500 rpm f. Aspire el sobrenadante; añadir 2-3 mL de tampón de tinción/lavado, p. ej., tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS) (n.º de cat. 554656) o tampón de tinción BD Pharmingen™ (BSA) (n.º de cat. 554657) g. Sedimentar las células mediante centrifugación (5 min) a 1400-1500 rpm h. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 500 μL de tampón de tinción/lavado para el análisis de citometría de flujo Protocolo 2 para tinción de células mononucleares de sangre periférica o muestras de sangre completa lisada de eritrocitos a granel en tubos a. Añadir 100 μL de células humanas a cada tubo b. Agitar en vórtex el contenido del tubo c. Incubar (30 min) las células suspendidas protegidas de la luz a temperatura ambiente (TA) d. Añadir 2 ml de tampón de tinción/lavado por tubo e. Sedimente las células por centrifugación (5 min) a 1400-1500 rpm f. Aspire el sobrenadante; agregue 2-3 mL de tampón de tinción/lavado g. Sedimente las células por centrifugación (5 min) a 1400-1500 rpm h. Aspire el sobrenadante y resuspenda las células en 500 μL de tampón de tinción/lavado para el análisis de citometría de flujo Protocolo 3 para tinción de células mononucleares de sangre periférica o muestras de sangre completa lisada por eritrocitos a granel en placas de 96 pocillos Nota: Al planificar la tinción en placas, el usuario debe tener en cuenta el volumen del tampón de tinción BD Horizon Brilliant utilizado. Aunque escrito para su uso con células humanas, este protocolo basado en placas de 96 pocillos puede adaptarse fácilmente para analizar células de ratón o células de otras especies. a. Agregue 50 μL de células humanas a cada pocillo b. Incube (30 min) protegido de la luz a TA c. Lavar añadiendo 100 μL de tampón de tinción/lavado. d. Sedimentar las células mediante centrifugación (5 min) a 1400-1500 rpm. e. Aspirar los sobrenadantes. f. Resuspender las células sedimentadas añadiendo 250 μL de tampón de tinción/lavado. g. Sedimentar las células mediante centrifugación (5 min) a 1400-1500 rpm. h. Aspirar los sobrenadantes. i. Resuspender completamente las células sedimentadas con 150 μL de tampón de tinción/lavado pipeteando las células suspendidas varias veces. j. Transfiera el contenido de los pocillos a los tubos y añada tampón de tinción/lavado adicional a los tubos según se desee para el análisis de citometría de flujo. Nota: Como alternativa, adquiera muestras para el análisis de citometría de flujo directamente de la placa. Tinción multicolor de muestras de células humanas en tubos o placas de 96 pocillos utilizando reactivos de tinción combinados. En lugar de añadir reactivos de tinción individualmente a cada tubo o pocillo de una placa de 96 pocillos, puede ser conveniente añadir reactivos de tinción combinados, es decir, mezclas de dos o más reactivos de tinción fluorescentes. El siguiente protocolo proporciona un ejemplo de cómo preparar un cóctel de anticuerpos fluorescentes de 5 colores "por prueba" que ya contiene tampón de tinción BD Horizon Brilliant. Muestras humanas: cócteles de reactivos fluorescentes premezclados Para cada prueba multicolor de reactivos fluorescentes combinados: i) Agregar 50 μL de tampón de tinción brillante BD Horizon por prueba ii) Agregar cada reactivo fluorescente al volumen recomendado por prueba (5 μL o 20 μL) iii) Mezclar los reactivos (especialmente después de agregar los reactivos BD Horizon Brilliant) iv) Almacenar el cóctel a 4 °C protegido de la luz si se va a usar más tarde Nota: Protegidos de la luz, los cócteles de reactivos fluorescentes que contienen más de un reactivo violeta brillante y/o azul brillante se utilizan mejor dentro de las 24 horas posteriores a la preparación cuando se almacenan a 4 °C o dentro de las 4 horas cuando se almacenan a temperatura ambiente. Sin embargo, cuando hay más de un reactivo ultravioleta brillante (BUV) en el cóctel, se utiliza mejor dentro de las 2 horas posteriores a la preparación, independientemente de la temperatura de almacenamiento. Ejemplo de creación de un cóctel de anticuerpos fluorescentes de 5 colores que contiene 2 conjugados Brilliant Violet™ diferentes Volumen final por prueba = 90 μL _____________________________________________________________________________________ Número total de pruebas Volumen/prueba (μL) 1 3 5 10 Tampón de tinción Brilliant 50 50 150 250 500 Reactivo 1 (BV) 5 5 15 25 50 Reactivo 2 (BV) 5 5 15 25 50 Reactivo 3 5 5 15 25 50 Reactivo 4 5 5 15 25 50 Reactivo 5 20 20 60 100 200 Volumen total 90 90 270 450 900 _____________________________________________________________________________________ Agregue el volumen deseado de cóctel de reactivos (90 μL en este Ejemplo de 5 colores) a todos los tubos o pocillos, utilizando los protocolos de tinción de células humanas descritos anteriormente. Compensación y configuración: El tampón de tinción BD Horizon Brilliant puede utilizarse en controles de compensación de un solo color con células. El tampón es compatible con BD™ Compbeads; sin embargo, no se ha probado con perlas de compensación de otros fabricantes. Para obtener la compensación más precisa, los controles de compensación creados con células o perlas deben exponerse al tampón de tinción BD Horizon Brilliant durante el mismo tiempo que el panel multicolor correspondiente. Además, la compensación más precisa se obtendrá al utilizar el tampón de tinción BD Horizon Brilliant en todos los controles de compensación, incluyendo colorantes poliméricos y no poliméricos brillantes.
Avisos del producto: Alexa Fluor® es una marca registrada de Life Technologies Corporation. El tampón de tinción brillante BD Horizon está cubierto por una o más de las siguientes patentes estadounidenses: 8,110,673; 8,158,444; 8,575,303; 8,354,239. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Consulte http://regdocs.bd.com para acceder a las fichas de datos de seguridad (FDS).