BD, 563974, BD Horizon™ BV605 Anexina V

Reactividad: Humana (Pruebas de control de calidad)
Isotipo: nulo nulo
Aplicación: Citometría de flujo (probada rutinariamente)
Vol. por prueba: 5 µl
ID de registro: AB_2869539
Tampón de almacenamiento: Solución tamponada acuosa que contiene BSA y ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C y protegido de la luz. No congelar.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados BD Horizon BV605 Annexin V es una sonda sensible para identificar células apoptóticas, que se une a superficies de fosfolípidos con carga negativa con una mayor afinidad por la fosfatidilserina (PS) que la mayoría de los demás fosfolípidos. La unión de BV605 Annexin V depende del calcio y se requieren concentraciones definidas de calcio y sal para una tinción óptima, como se describe en el Protocolo de tinción de BV605 Annexin V. Los investigadores deben tener en cuenta que el análisis de citometría de flujo de BV605 Annexin V en tipos de células adherentes (p. ej., HeLa, NIH-3T3, etc.) no se prueba de forma rutinaria, ya que puede producirse un daño específico de la membrana durante el desprendimiento o la recolección de células. Sin embargo, se han informado previamente métodos para utilizar Annexin V para citometría de flujo en tipos de células adherentes (Casiola-Rosen et al. y van Engelend et al.). Para obtener resultados óptimos y reproducibles, se debe utilizar el tampón de tinción BD Horizon Brilliant siempre que se utilicen dos o más colorantes BD Horizon Brilliant en el mismo experimento. Las interacciones de los colorantes fluorescentes pueden causar artefactos de tinción que pueden afectar la interpretación de los datos. El tampón de tinción BD Horizon Brilliant se diseñó para minimizar estas interacciones. Puede encontrar más información en la hoja de datos técnicos del tampón de tinción BD Horizon Brilliant (n.º de cat. 563794). INDUCCIÓN DE LA APOPTOSIS POR CAMPTOTECINA El siguiente protocolo se proporciona como ilustración de cómo se puede utilizar BV605 Annexin V en una línea celular (Jurkat). Materiales 1. Prepare la solución madre de camptotecina (Sigma-Aldrich n.º de cat. C-9911): 1 mM en DMSO. 2. Células T Jurkat (ATCC TIB-152). Procedimiento 1. Añada camptotecina (concentración final 4-6 µM) a 1 × 10^6 células Jurkat. 2. Incube las células durante 4-6 horas a 37 °C. 3. Proceda con el protocolo de tinción de anexina V BV605 para medir la apoptosis. Reactivos 1. BD Horizon BV605 Anexina V: Incluido. Use 5 µl por prueba. 2. 7-aminoactinomicina D (7-AAD): No incluido. El 7-AAD (n.º de cat. 559925) es un colorante de ácido nucleico práctico y listo para usar con fluorescencia detectable en el rango rojo lejano del espectro. Use 5 µl por prueba. 3. Tampón de unión a anexina 10X: No incluido. Hepes 0,1 M (pH 7,4), NaCl 1,4 M, CaCl₂ 25 mM. Conservar a 4 °C. Alternativamente, se puede adquirir el concentrado 10X de tampón de unión de anexina V BD Pharmingen™ (n.º de cat. 556454). PROTOCOLO DE TINCIÓN DE ANEXINA V BD Horizon BV605 Tinción 1. Lavar las células dos veces con PBS frío y, a continuación, resuspenderlas en tampón de unión 1× a una concentración de 1 × 10^6 células/ml. 2. Transferir 100 µl de la suspensión celular (1 × 10^5 células) a un tubo de cultivo de 5 ml. 3. Añadir 5 µl de anexina V BV605 (para análisis de uno y dos colores) y 5 µl de 7-AAD (solo para análisis de dos colores). 4. Agitar suavemente las células con vórtex e incubar durante 15 min a temperatura ambiente (25 °C) en oscuridad. 5. Añada 400 µl de tampón de unión a anexina V 1× a cada tubo. Analice mediante citometría de flujo en 1 hora. CONTROLES SUGERIDOS PARA CONFIGURAR LA CITOMETRÍA DE FLUJO Los siguientes controles se utilizan para configurar la compensación y los cuadrantes: 1. Células sin teñir. 2. Células teñidas solo con anexina V BV605 (sin 7-AAD). 3. Células teñidas solo con 7-AAD (sin anexina V BV605). Otros controles de tinción: Se debe utilizar una línea celular que pueda inducirse fácilmente a apoptosis para obtener una tinción de control positiva con anexina V BV605 sola o con anexina V BV605 y 7-AAD. Es importante tener en cuenta que el nivel basal de apoptosis y necrosis varía considerablemente dentro de una población. Por lo tanto, incluso en ausencia de apoptosis inducida, la mayoría de las poblaciones celulares contendrán un pequeño porcentaje de células con apoptosis positiva (BV605 Anexina V positiva, 7-AAD negativa, o BV605 Anexina V positiva, 7-AAD positiva). La población no tratada se utiliza para definir el nivel basal de células apoptóticas y muertas. El porcentaje de células inducidas a apoptosis se determina restando el porcentaje de células apoptóticas en la población no tratada del porcentaje de células apoptóticas en la población tratada. Dado que la muerte celular es el resultado final de las células que experimentan apoptosis, las células en las últimas etapas de la apoptosis tendrán una membrana dañada y se teñirán de forma positiva para 7-AAD así como para BV605 Annexin V. Por lo tanto, el ensayo no distingue entre células que ya han experimentado una muerte celular apoptótica y aquellas que han muerto como resultado de la vía necrótica, porque en cualquier caso las células muertas se teñirán tanto con BV605 Annexin V como con 7-AAD.
Avisos del producto: Avisos del producto Este reactivo ha sido prediluido para su uso al volumen recomendado por prueba. Normalmente usamos 1 × 10^6 células en una muestra experimental de 100 µl (una prueba). Tenga en cuenta las siguientes precauciones: La absorción de luz visible puede alterar significativamente la transferencia de energía que ocurre en cualquier conjugado de fluorocromo en tándem; por lo tanto, recomendamos tomar precauciones especiales (como envolver viales, tubos o gradillas en papel de aluminio) para evitar la exposición de los reactivos conjugados, incluidas las células teñidas con esos reactivos, a la iluminación ambiental. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. La fuente de todas las proteínas séricas proviene de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en los Estados Unidos. Si bien se hace todo lo posible para minimizar la variación entre lotes en la eficiencia de la transferencia de energía del fluorocromo, pueden observarse diferencias en la emisión residual de BD Horizon™ BV421. Por lo tanto, recomendamos realizar controles de compensación individuales para cada conjugado BD Horizon™ BV605. CF™ es una marca registrada de Biotium, Inc. Para obtener información sobre los espectros de fluorocromo y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web de citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. Para consultar los protocolos técnicos, visite www.bdbiosciences.com/us/s/resources.