BD, 564061, BD Pharmingen™ Calceína AM

Aplicación: Bioimagen, citometría de flujo (probada durante el desarrollo)
ID de registro: AB_2869545
Estado regulatorio: RUO
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Preparación Lleve el polvo de calceína AM de BD Pharmingen™ y el dimetilsulfóxido de grado de cultivo celular fresco (DMSO; p. ej., Sigma, n.º de cat. D2650) a temperatura ambiente. Añada 201 μl de DMSO para preparar una solución madre de 5 mM (masa molar = 994,86 g/mol) y agite bien la solución en vórtex. Inspeccione la solución y repita el vórtex hasta que el colorante madre se haya disuelto completamente. Almacenamiento Almacene la calceína AM de BD Pharmingen™ desecada a -80 °C hasta su uso. Después de la reconstitución con DMSO, almacene la solución a -20 °C en pequeñas alícuotas. Evite los ciclos de congelación y descongelación. Deseche las alícuotas del colorante después de 6 meses de la reconstitución con DMSO. Notas • Cuando se diluye con una solución acuosa, BD Pharmingen™ Calcein AM debe usarse inmediatamente después de la dilución, ya que el colorante escindible por esterasa puede hidrolizarse espontáneamente con una exposición acuosa prolongada. • Tenga en cuenta que estos colorantes son escindibles por esterasa. El suero puede tener actividad de esterasa y los tampones que contienen suero pueden disminuir la resolución de las células viables y no viables si se usan durante la tinción. Los tampones que contienen suero pueden usarse para los pasos de lavado una vez completada la tinción. • Las propiedades de derrame de este colorante son similares a las de FITC. Como tal, recomendamos una compensación adecuada para otros colores excitados por el láser azul, como PE o PerCP-Cy™5.5. Además, recomendamos usar células teñidas con BD Pharmingen™ Calcein AM para compensación. • Este colorante no es fijable. Procedimiento general 1. Prepare las células para la tinción de citometría de flujo usando un tampón sin suero (p. ej., solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco 1 X). 2. Lave las células una vez en tampón sin suero. 3. Resuspenda las células a ~1-10 x 10^6 células/ml en colorante diluido en tampón sin suero. a. Recomendamos teñir a una concentración final de 1-10 μM de colorante BD Pharmingen™ Calcein AM para la discriminación de células vivas/muertas, o a 0,1-1 μM para aplicaciones multicolor como punto de partida. Dado que la intensidad de la fluorescencia puede variar en función del tipo de célula y las condiciones experimentales, se recomienda una titulación para determinar la concentración óptima de colorante para cada protocolo experimental. 4. Incube la mezcla durante 30 minutos a temperatura ambiente protegida de la luz. 5. Lave las células dos veces con 2 ml de tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS) o equivalente. 6. Aspire el sobrenadante y mezcle suavemente para romper el sedimento celular. 7. Resuspenda las células en tampón de tinción (FBS) o equivalente. 8. Analice mediante citometría de flujo o tiña las células según se desee para aplicaciones posteriores. Notas sobre células adherentes Las células adherentes pueden teñirse en suspensión o in situ. Para teñir células adherentes en suspensión, siga el "Procedimiento general" como se describe arriba después de la disociación celular en una suspensión de células individuales. Tenga en cuenta que para algunas células, la eliminación enzimática del sustrato de crecimiento puede afectar la integridad de la membrana celular, lo que puede afectar la tinción con BD Pharmingen™ Calcein AM. Se recomienda dejar que las células se recuperen de la disociación enzimática en medios de crecimiento. El tiempo de recuperación puede variar según la línea celular, por lo que puede ser útil probar múltiples períodos de recuperación en experimentos iniciales. Para teñir in situ, recomendamos el siguiente protocolo: 1. Retire los medios y lave las células una vez con tampón sin suero para eliminar cualquier medio restante. 2. Agregue el tinte diluido en tampón sin suero al cultivo. a. Recomendamos teñir a una concentración de 1-10 μM del colorante BD Pharmingen™ Calcein AM para la discriminación de células vivas/muertas, o a 0,1-1 μM para aplicaciones multicolor. Dado que el brillo puede variar según el tipo de célula y las condiciones experimentales, se recomienda una titulación para determinar la concentración óptima del colorante para cada protocolo experimental. 3. Incubar la mezcla durante 30-60 minutos a 37 °C protegida de la luz. 4. Lavar los cultivos dos veces con BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS) o equivalente. 5. Retirar las células del sustrato de crecimiento. Recomendamos usar la solución de desprendimiento de células BD™ Accutase™. a. Lavar las células dos veces con BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS) o equivalente. b. Resuspender las células en Stain Buffer (FBS) o equivalente. c. Analizar por citometría de flujo o teñir las células como se desee para aplicaciones posteriores.
Avisos del producto: Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Para conocer los espectros de fluorocromos y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web de citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. Accutase es una marca registrada de Innovative Cell Technologies, Inc. Todas las demás marcas son marcas comerciales de sus respectivos propietarios. Cy es una marca comercial de GE Healthcare. Antes de teñir con este reactivo, confirme que su citómetro de flujo sea capaz de excitar el fluorocromo y discriminar la fluorescencia resultante. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para obtener los protocolos técnicos.