BD, 564405, Tinción de viabilidad reparable BD Horizon™ 660

Aplicación: Citometría de flujo, tinción intracelular (citometría de flujo) (probado durante el desarrollo)
ID de registro: AB_2869571
Estado regulatorio: RUO
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Preparación Lleve el polvo de colorante FVS660 y 190 μl de dimetilsulfóxido (DMSO; p. ej., Sigma D2650) fresco de grado de cultivo celular a temperatura ambiente. Agregue 190 μl de DMSO y agite bien la solución. Inspeccione la solución y repita el agitado hasta que el colorante madre se haya disuelto completamente. Esta es la solución madre. Almacenamiento Al recibirlo, almacene el colorante seco desecado y protegido de la luz a -80 °C hasta su uso. Después de la reconstitución con DMSO, almacene la solución madre a -20 °C en pequeñas alícuotas. No use el colorante reconstituido después de 90 días de almacenamiento. Deseche la solución de colorante después de 90 días de la reconstitución con DMSO. Requisitos de citometría Se pueden utilizar citómetros de flujo equipados con láser rojo (p. ej., BD FACSCanto™ II, BD LSRFortessa™, BD™ LSR II o BD Accuri™ C6). Este colorante se puede leer en filtros comúnmente utilizados para APC o Alexa Fluor® 647 (p. ej., 660/20 o 670/30). La compensación de fluorescencia se logra mejor utilizando una muestra de las células de interés. Procedimiento Marcaje de células con tinción de viabilidad fijable 660 1. Prepare las células para la tinción de citometría de flujo utilizando tampones sin azida sódica. 2. Lave las células una vez en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (1X DPBS) sin azida sódica ni proteínas. 3. Resuspenda las células a 1-10x10^6 células/ml en 1X DPBS sin azida sódica ni proteínas. 4. Añada 1 μl de la solución madre BD Horizon™ Fixable Viability Stain 660 por cada ml de suspensión celular (1:1000) y agite inmediatamente con vórtex. a. Nota: Recomendamos titular el colorante para un rendimiento óptimo, ya que los diferentes tipos de células y aplicaciones pueden dar lugar a una amplia variabilidad en la tinción. Lea la Nota 1 a continuación para obtener orientación sobre los rangos recomendados. 5. Incube la mezcla durante 10-15 minutos a temperatura ambiente o a 2-8 °C protegida de la luz. a. Opcional: Como alternativa, incube las mezclas a 37 °C durante 5-7 minutos. 6. Lave las células dos veces con 2 ml de tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS) (n.º de cat. 554656) o equivalente. 7. Decante el sobrenadante y mezcle suavemente para romper el sedimento celular. 8. Resuspenda las células en tampón de tinción (FBS) o equivalente. 9. Teñir, fijar y permeabilizar las células según se desee para aplicaciones posteriores. Notas: 1. Cada usuario debe determinar las concentraciones óptimas de reactivos, células y condiciones para el ensayo de interés. Recomendamos titular el reactivo en los primeros experimentos para obtener resultados óptimos. Los siguientes son rangos que hemos encontrado que funcionan para varios sistemas celulares: a. Sangre completa lisada: 1:1000 de la solución madre. b. Células primarias: 1:1000 - 1:4000 de la solución madre. c. Líneas celulares: 1:4000 - 1:10 000 de la solución madre. 2. La reactividad del colorante libre se extingue lavando con un tampón que contiene proteína (p. ej., FBS o BSA). 3. Las células pueden teñirse en masa antes de congelarlas o teñirlas con anticuerpos fluorescentes. 4. El tinte de viabilidad fijable BD Horizon™ 660 se puede utilizar en ensayos de tinción intracelular que requieren fijación con formaldehído y permeabilización con metanol y detergentes, como los utilizados para la tinción con BD Phosflow™ (p. ej., n.º de cat. 558050, tampón de permeación BD Phosflow™ III), tinción de citocinas intracelulares (p. ej., n.º de cat. 554714, kit de fijación/permeabilización BD Cytofix/Cytoperm™) o tinción de factores de transcripción (p. ej., n.º de cat. 562574/562725, juego de tampones de factores de transcripción BD Pharmingen™). 5. Las células apoptóticas pueden mostrar una tinción variable. Se recomienda la cotinción con, p. ej., anexina V FITC (n.º de cat. 556419) si se desea un análisis más detallado de las células apoptóticas.
Avisos del producto: Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Para conocer los espectros de fluorocromos y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web de citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. Alexa Fluor® es una marca registrada de Molecular Probes, Inc., Eugene, OR. Antes de teñir con este reactivo, confirme que su citómetro de flujo sea capaz de excitar el fluorocromo y discriminar la fluorescencia resultante. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para conocer los protocolos técnicos.