BD, 564696, BD Pharmingen™ MitoStatus TMRE

Aplicación: Bioimagen, citometría de flujo, inmunofluorescencia (probada durante el desarrollo)
ID de registro: AB_2869606
Estado regulatorio: RUO
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Preparación del colorante Lleve el colorante en polvo BD Pharmingen™ MitoStatus TMRE y el dimetilsulfóxido (DMSO; p. ej., Sigma D2650) de grado de cultivo celular fresco a temperatura ambiente. Reconstituya el colorante en polvo TMRE en DMSO a una concentración madre de 0,2-1 mM. Por ejemplo, 1 mg de BD Pharmingen™ MitoStatus TMRE se puede disolver en 1,94 ml de DMSO para obtener una solución madre de 1 mM (PM = 514,96 g/mol). Almacenamiento del colorante A su llegada, almacene el colorante en polvo desecado y protegido de la luz a ≤ -20 °C hasta su uso. El colorante en polvo es estable durante al menos 12 meses si se almacena como se indica. Después de la reconstitución con DMSO, almacene la solución madre a ≤ -20 °C en pequeñas alícuotas. La solución madre es estable durante al menos 6 meses si se almacena como se indica. Requisitos de citometría de flujo Antes de teñir con este reactivo, confirme que su citómetro de flujo es capaz de excitar el fluorocromo y discriminar la fluorescencia resultante. Se pueden utilizar citómetros de flujo (p. ej., BD FACSCanto™ II, BD LSRFortessa™, BD™ LSR II o BD Accuri™ C6) equipados con un láser azul (p. ej., 488 nm) o amarillo-verde (p. ej., 561 nm). La fluorescencia del colorante TMRE se puede detectar con filtros comúnmente utilizados para ficoeritrina (PE) (p. ej., 575/26 o 582/15 nm). La compensación de la fluorescencia se logra mejor utilizando las muestras celulares de interés. Al diseñar paneles de tinción fluorescente multicolor, tenga en cuenta el alto derrame de fluorescencia en los detectores de los siguientes fluorocromos: BD Horizon™ PE-CF594, BV605, BV650 o PerCP-Cy™5.5. Recomendamos titular el colorante y usar la concentración más baja que proporcione una resolución adecuada de las poblaciones de células polarizadas y despolarizadas para reducir el derrame de fluorescencia. Procedimiento Marcaje de células suspendidas con BD Pharmingen™ MitoStatus TMRE para análisis de citometría de flujo 1. Cuente las células para determinar la densidad celular. Ajuste la densidad celular a 1 × 10^6 células/mL o menos en medio de cultivo celular fresco y precalentado. 2. Teñir las células en medio de cultivo celular fresco y precalentado o en el tampón de tinción deseado con 20-200 nM de BD Pharmingen™ MitoStatus TMRE en un recipiente de polipropileno añadiendo la solución madre directamente a las células a la concentración deseada. a. Nota: BD Pharmingen™ MitoStatus TMRE también puede añadirse directamente al cultivo en lugar de teñir en medio fresco. La tinción también se puede realizar en tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS) precalentado (n.º de cat. 554656) o PBS precalentado. El PBS puede proporcionar una mayor resolución para algunos tipos de células, pero también puede aumentar la tinción de fondo. b. Nota: Se sabe que el TMRE se adhiere al poliestireno. Las muestras se deben teñir en recipientes de polipropileno. c. Nota: Para facilitar la selección de la citometría de flujo, recomendamos utilizar células de control tratadas solo con vehículo o células tratadas con un desacoplador mitocondrial, como FCCP [cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona, p. ej., Sigma n.º de cat. C2920]. 3. Incubar las muestras durante 15-30 minutos a 37 °C protegidas de la luz. 4. Lavar las células dos veces con tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS). 5. Decantar el sobrenadante y mezclar suavemente para romper el sedimento celular. 6. Resuspenda las células en tampón de tinción (FBS). 7. Analice las células mediante citometría de flujo. Como alternativa, contratine las células con colorantes fluorescentes compatibles o anticuerpos según se desee y luego analice. Marcaje de células adherentes con BD Pharmingen™ MitoStatus TMRE para análisis de citometría de flujo 1. Las células adherentes deben teñirse in situ a ≤ 70 % de confluencia. Tiña las células en medios de cultivo celular frescos y precalentados o en el tampón de tinción deseado con 20-200 nM de BD Pharmingen™ MitoStatus TMRE añadiendo la solución madre directamente a las células a la concentración deseada. a. Nota: BD Pharmingen™ MitoStatus TMRE también puede añadirse directamente al cultivo en lugar de teñir en medios frescos. La tinción también puede realizarse en tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS) precalentado o en PBS de Dulbecco (DPBS) precalentado. DPBS puede proporcionar una mayor resolución para algunos tipos de células, pero también puede resultar en una mayor tinción de fondo. b. Nota: Para ayudar en la selección por citometría de flujo, recomendamos usar células de control tratadas solo con vehículo y/o células tratadas con un desacoplador mitocondrial, como FCCP. 2. Incubar las muestras durante 15-30 minutos a 37 °C protegidas de la luz. 3. Lavar las células dos veces con BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS). 4. Retirar las células del medio de crecimiento. Recomendamos usar BD™ Accutase™ Cell Detachment Solution (Cat. No. 561527). 5. Lavar las células dos veces con BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS) o equivalente. 6. Decantar el sobrenadante y mezclar suavemente para romper el sedimento celular. 7. Resuspender las células en Stain Buffer (FBS). 8. Analizar las células por citometría de flujo. Como alternativa, contrateñir las células con colorantes fluorescentes compatibles o anticuerpos según se desee y luego analizar. Notas: 1. Este colorante no es compatible con la fijación celular. 2. Cada usuario debe determinar las concentraciones óptimas de reactivos, células y condiciones para el ensayo de interés. Recomendamos titular el reactivo en los primeros experimentos para obtener resultados óptimos. 3. Las células pueden teñirse en masa antes de teñirlas con anticuerpos fluorescentes. Marcaje de células con BD Pharmingen™ MitoStatus TMRE para imágenes fluorescentes 1. Teñir las células en un medio fresco precalentado con 20-200 nM de BD Pharmingen™ MitoStatus TMRE. 2. Incubar las muestras durante 15-30 minutos a 37 °C protegidas de la luz. 3. Retirar la solución de tinción y reemplazarla con DPBS precalentado. 4. Analizar las células mediante imágenes de fluorescencia. Como alternativa, contrateñir las células con colorantes fluorescentes compatibles o anticuerpos según se desee y luego analizar.
Avisos del producto: Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Para conocer los espectros de fluorocromos y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web de citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. Accutase es una marca registrada de Innovative Cell Technologies, Inc. Cy es una marca registrada de GE Healthcare. Antes de teñir con este reactivo, confirme que su citómetro de flujo sea capaz de excitar el fluorocromo y discriminar la fluorescencia resultante. Consulte los protocolos técnicos en www.bdbiosciences.com/us/s/resources.