BD, 564697, BD Pharmingen™ MitoStatus Rojo

Aplicación: Bioimagen, citometría de flujo, inmunofluorescencia (probada durante el desarrollo)
ID de registro: AB_2869607
Estado regulatorio: RUO
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Preparación Lleve un vial de 50 μg de colorante en polvo BD Pharmingen™ MitoStatus Red y dimetilsulfóxido (DMSO; p. ej., Sigma D2650) fresco de grado de cultivo celular a temperatura ambiente. Para reconstituir el colorante en polvo BD Pharmingen™ MitoStatus Red en DMSO a una concentración madre de 0,2 mM, añada 460 μL de DMSO a un vial de colorante en polvo. Almacenamiento A su llegada, almacene el colorante en polvo desecado y protegido de la luz a ≤ -20 °C hasta su uso. El colorante en polvo es estable durante al menos 12 meses si se almacena como se indica. Después de la reconstitución con DMSO, almacene la solución madre a ≤ -20 °C en pequeñas alícuotas. La solución madre es estable durante al menos 6 meses si se almacena como se indica. Requisitos de citometría Antes de teñir con este reactivo, confirme que su citómetro de flujo es capaz de excitar el fluorocromo y discriminar la fluorescencia resultante. Se pueden utilizar citómetros de flujo (p. ej., BD FACSCanto™ II, BD LSRFortessa™, BD™ LSR II o BD Accuri™ C6) equipados con un láser rojo (p. ej., 633 nm). Este colorante se puede leer en filtros comúnmente utilizados para APC o Alexa Fluor® 647 (p. ej., 660/20 o 670/30). La compensación de la fluorescencia se logra mejor utilizando una muestra de las células de interés. Al diseñar paneles de tinción fluorescente multicolor, tenga en cuenta el alto derrame en los detectores de los siguientes fluorocromos: Alexa Fluor® 700, APC-H7, PerCP-Cy™5.5, BV711 o BV786. Recomendamos titular el colorante y usar la concentración más baja posible que proporcione una resolución adecuada de las poblaciones polarizadas y despolarizadas para el tipo celular de interés para reducir el derrame. Procedimiento Marcaje de células suspendidas con BD Pharmingen™ MitoStatus Red para análisis de citometría de flujo 1. Cuente las células para determinar la densidad celular. Ajuste la densidad celular a 1 × 10^6 células/ml o menos en medio de cultivo celular fresco y precalentado. 2. Teñir las células en medio de cultivo celular fresco y precalentado o en el tampón de tinción deseado con 20-200 nM de BD Pharmingen™ MitoStatus Red en un recipiente de polipropileno añadiendo la solución madre directamente a las células a la concentración deseada. a. Nota: BD Pharmingen™ MitoStatus Red también puede añadirse directamente al cultivo en lugar de teñir en medio fresco. La tinción también puede realizarse en tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS) precalentado (n.º de cat. 554656) o PBS de Dulbecco precalentado. El DPBS puede proporcionar una mayor resolución para algunos tipos de células, pero también puede aumentar la tinción de fondo. b. Nota: Para facilitar la selección por citometría de flujo, recomendamos usar células de control tratadas solo con vehículo o un desacoplador mitocondrial, como FCCP [cianuro de carbonilo 4 (trifluorometoxi)fenilhidrazona, p. ej., Sigma, n.º de cat. C2920]. 3. Incubar las muestras durante 15-30 minutos a 37 °C protegidas de la luz. 4. Lavar las células dos veces con tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS) (n.º de cat. 554656). 5. Decantar el sobrenadante y mezclar suavemente para romper el sedimento celular. 6. Resuspenda las células en tampón de tinción (FBS). 7. Analice las células mediante citometría de flujo. Como alternativa, contratine las células con colorantes fluorescentes compatibles o anticuerpos según se desee y luego analice. Marcaje de células adherentes con BD Pharmingen™ MitoStatus Red para citometría de flujo 1. Las células adherentes deben teñirse in situ al 70 % de confluencia o menos. Tiña las células en un medio de cultivo celular fresco y precalentado o en el tampón de tinción deseado con BD Pharmingen™ MitoStatus Red 20-200 nM añadiendo la solución madre directamente a las células a la concentración deseada. a. Nota: BD Pharmingen™ MitoStatus Red también puede añadirse directamente al cultivo en lugar de teñir en medio fresco. La tinción también puede realizarse en tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS) precalentado o en DPBS precalentado. El DPBS puede proporcionar una mayor resolución para algunos tipos de células, pero también puede provocar una mayor tinción de fondo. b. Nota: Para facilitar la selección por citometría de flujo, recomendamos usar células de control tratadas solo con vehículo y/o un desacoplador mitocondrial, como FCCP. 2. Incubar las muestras durante 15-30 minutos a 37 °C protegidas de la luz. 3. Lavar las células dos veces con tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS). 4. Retirar las células del medio de crecimiento. Recomendamos usar la solución de desprendimiento de células BD ™ Accutase ™ (n.º de cat. 561527). 5. Lavar las células dos veces con tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS). 6. Decante el sobrenadante y mezclar suavemente para romper el sedimento celular. 7. Resuspender las células en tampón de tinción (FBS) o equivalente. 8. Analizar las células mediante citometría de flujo. Como alternativa, contrateñir las células con colorantes fluorescentes compatibles o anticuerpos según se desee y luego analizar. Notas: 1. Este colorante no es compatible con la fijación. 2. Cada usuario debe determinar las concentraciones óptimas de reactivos, células y condiciones para el ensayo de interés. Recomendamos titular el reactivo en los primeros experimentos para obtener resultados óptimos. 3. Las células pueden teñirse en masa antes de teñirlas con anticuerpos fluorescentes. Marcaje de células con BD Pharmingen™ MitoStatus Red para imágenes fluorescentes: 1. Teñir las células en un medio fresco precalentado con 20-200 nM de BD Pharmingen™ MitoStatus Red. 2. Incubar las muestras durante 15-30 minutos a 37 °C, protegidas de la luz. 3. Retirar la solución de tinción y reemplazarla con PBS precalentado. 4. Analizar las células mediante imágenes de fluorescencia. Como alternativa, contrateñir las células con colorantes fluorescentes o anticuerpos compatibles, según se desee, y luego analizar.
Avisos del producto: Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Accutase es una marca registrada de Innovative Cell Technologies, Inc. Alexa Fluor® es una marca registrada de Molecular Probes, Inc., Eugene, OR. Para obtener información sobre los espectros de fluorocromos y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web de citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. Cy es una marca registrada de GE Healthcare. Antes de teñir con este reactivo, confirme que su citómetro de flujo sea capaz de excitar el fluorocromo y discriminar la fluorescencia resultante. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para conocer los protocolos técnicos.