BD, 565082, BD Horizon™ CFSE

Aplicación: Tinción intracelular (citometría de flujo) (Probado rutinariamente)
ID de registro: AB_2869649
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: Preparación y almacenamiento Conservar a -20°C, protegido de la exposición a la luz.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Materiales proporcionados Colorante CFSE (2 viales, 500 μg de colorante por vial) Materiales necesarios pero no proporcionados • Suspensiones viables de células individuales de células linfoides primarias de interés • Dimetilsulfóxido de grado de cultivo celular fresco (DMSO; p. ej., Sigma D2650) • Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco estéril (1× DPBS) • Medio de cultivo celular, p. ej., con 10% de suero fetal bovino (FBS) • Tubos cónicos estériles de polipropileno de 15 ml o 50 ml • Tubos de microcentrífuga o crioviales de 2 ml • Anticuerpos fluorescentes para análisis inmunofenotípico o funcional (opcional) Equipo necesario • Citómetro equipado con láser azul; p. ej., BD FACSCanto™ II, BD LSRFortessa™, citómetro de flujo BD LSR™ II o BD Accuri™ C6 • Centrífuga • Incubadora de CO2 a 37 °C y baño de agua a 37 °C Almacenamiento A su llegada, almacene el colorante en polvo con desecante y protegido de la luz a ≤ -20 °C hasta su uso. Después de la reconstitución con DMSO, almacene la solución madre con desecante a ≤ -20 °C en pequeñas alícuotas. La solución madre es estable durante 3 meses si se almacena como se indica. Procedimiento CFSE tiene una absorción máxima de 490 nm y una emisión máxima de 520 nm. Antes de teñir con este reactivo, confirme que su citómetro de flujo es capaz de excitar el fluorocromo y discriminar la fluorescencia emitida. Preparación de la solución de colorante CFSE en DMSO 1. Prepare una solución madre de colorante CFSE de 10 mM añadiendo 90 μL de DMSO a un vial de CFSE. Mezcle bien con vórtex. 2. Prepare alícuotas de un solo uso de la solución madre de CFSE (volumen definido por el usuario) utilizando tubos de microcentrífuga etiquetados adecuadamente o crioviales de 2 mL. 3. Congele todas las alícuotas a ≤ -20 °C con desecante y protéjalas de la luz. Marcaje de células con CFSE Este procedimiento ha sido optimizado para marcar linfocitos de ratón y humanos a concentraciones celulares de 10-30 × 10^6 células/mL. Es posible que sea necesario optimizar las condiciones del ensayo para otros tipos o densidades celulares. 1. Descongele la solución madre de CFSE de 10 mM, si se congeló previamente. 2. Transfiera las células a tubos de centrífuga de polipropileno de 15 o 50 mL. 3. Lave las células en 1× DPBS para eliminar cualquier proteína sérica residual. 4. Repita el paso 3. 5. Resuspenda las células completamente en una suspensión de células individuales a una concentración de 10-30 × 10^6 células/mL en 1× DPBS. a. Nota: Evite la tinción en tampones que contengan azida, suero o proteínas, ya que estas fracciones se unen al colorante libre y pueden interferir con la tinción de las células. 6. Agregue CFSE stock a la suspensión de células individuales para lograr una concentración final de 1-10 μM. Si es necesario, la solución stock puede diluirse más con DMSO antes de agregarla a la suspensión de células individuales. Agite en vórtex inmediatamente. 7. Incube la suspensión de células y colorante en un baño de agua a 37 °C durante 10-15 minutos. 8. Agregue 9× el volumen original de 1× DPBS a las células y sedimente las células mediante centrifugación. 9. Decante el sobrenadante y mezcle suavemente para romper el sedimento celular. 10. Añada 10 ml de medio completo con 10 % de SFB y repita la centrifugación. 11. Decante el sobrenadante y mezcle suavemente para romper el sedimento celular. 12. Resuspenda las células en medio completo y proceda al cultivo celular o al análisis por citometría de flujo. Notas: 1. Confirme la luminosidad del marcado celular comparando las células marcadas con las células de control sin marcar. 2. BD Horizon™ CFSE se puede utilizar en ensayos de tinción intracelular que requieren fijación con formaldehído y permeabilización con metanol y detergentes, como los utilizados para la tinción con BD Phosflow™ (p. ej., BD Phosflow™ Perm Buffer III, n.º de cat. 558050), tinción intracelular de citocinas (p. ej., BD Cytofix/Cytoperm™ Fixation/Permeablization Kit, n.º de cat. 554714) o tinción de factores de transcripción (p. ej., BD Pharmingen™ Transcription Factor Buffer Set, n.º de cat. 562574/562725). 3. Se pueden lograr mayores intensidades de tinción iniciales aumentando la concentración inicial de carga del colorante CFSE. Sin embargo, al igual que con otros colorantes de seguimiento que contienen ésteres succinimidílicos, concentraciones de carga más altas pueden provocar un aumento de la toxicidad celular o la muerte celular.
Avisos del producto: Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Para conocer los espectros de fluorocromos y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web de citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. Cy es una marca registrada de GE Healthcare. Antes de teñir con este reactivo, confirme que su citómetro de flujo sea capaz de excitar el fluorocromo y discriminar la fluorescencia resultante. Consulte los protocolos técnicos en www.bdbiosciences.com/us/s/resources.