BD, 565521, sonda de caspasa de células vivas violeta BD Pharmingen™

Aplicación: Citometría de flujo, tinción intracelular (citometría de flujo) (probado durante el desarrollo)
ID de registro: AB_2869682
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: Preparación y almacenamiento Conservar a -20°C, protegido de la exposición a la luz.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Nota: Antes de teñir, confirme que su citómetro de flujo es capaz de excitar el fluorocromo y discriminar la fluorescencia resultante. Preparación Lleve la sonda liofilizada y 50 μl de dimetilsulfóxido (DMSO; p. ej., Sigma D2650) fresco de grado de cultivo celular a temperatura ambiente. Agregue 50 μl de DMSO y agite bien la solución. Inspeccione la solución y repita el agitado hasta que el colorante madre se haya disuelto completamente. Esta es la solución madre. Almacenamiento Al recibirla, almacene la sonda seca, desecada y protegida de la luz a -20 °C hasta su uso. Después de la reconstitución con DMSO, almacene la solución madre a -20 °C en pequeñas alícuotas. La solución madre es estable durante al menos 3 meses después de la reconstitución con DMSO. Requisitos de citometría Se pueden utilizar citómetros de flujo equipados con láser violeta (p. ej., BD FACSCanto™ II, BD LSRFortessa™ y BD™ LSR II). Este colorante se puede leer en filtros comúnmente utilizados para BD Horizon™ BV421 (p. ej., 450/40 nm). La compensación de fluorescencia se logra mejor utilizando una muestra de las células de interés teñidas con el colorante. Al diseñar paneles multicolor, recomendamos titular el colorante y utilizar la concentración más baja posible que proporcione una resolución adecuada de las poblaciones positivas y negativas para el tipo de célula de interés para reducir el derrame. Procedimiento Marcado de células con la sonda de caspasa de células vivas violeta BD Pharmingen™ 1. Cuente las células para determinar la densidad celular. Ajuste la densidad celular a 1-2 × 10^6 células/ml en medio de cultivo celular fresco y precalentado. a. Las células adherentes se pueden teñir in situ o en suspensión después de retirarlas del sustrato de crecimiento. Las células deben tener una confluencia del 70 % o menos al analizarlas. b. Nota: Una "prueba" se define como una alícuota de 500 μL de células a una concentración de 1-2 × 10^6 células/ml. 2. Añada 2 μL de solución madre por cada 1 mL de suspensión celular o medio de cultivo. Por ejemplo, para una alícuota de 500 μL de células, añada 1 μL de solución madre. Mezcle bien. a. En algunos casos, puede ser útil titular la sonda, ya que los diferentes tipos de células y las diferentes aplicaciones pueden variar la intensidad de la tinción. 3. Incube las muestras durante 30-60 minutos a 37 °C, protegidas de la luz. 4. Lave las células una vez con medio fresco precalentado. 5. Resuspenda las células en medio fresco precalentado e incube las células durante 15-60 minutos adicionales a 37 °C, protegidas de la luz, para permitir que la sonda no unida se difunda fuera de las células. 6. Sedimente las células nuevamente mediante centrifugación y retire el sobrenadante. 7. Resuspenda las células en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) 1× o equivalente. a. Nota: Las células muertas se unen a cantidades variables de sonda. Recomendamos la cotinción con, por ejemplo, la solución de viabilidad celular BD Via-Probe™ (n.° de cat. 555816) para distinguir las células muertas de las células vivas o apoptóticas. 8. Analice las muestras mediante citometría de flujo. Notas: 1. Cada usuario debe determinar las concentraciones óptimas de reactivos, células y condiciones para el ensayo de interés. Recomendamos titular el reactivo en los primeros experimentos para obtener resultados óptimos. 2. La sonda de caspasa de células vivas violeta BD Pharmingen™ es compatible con protocolos de fijación y permeabilización, como los utilizados para la tinción con BD Phosflow™ (p. ej., n.° de cat. 558050, tampón de permeación BD Phosflow™ III) o la tinción de citocinas intracelulares (p. ej., n.° de cat. 554714, kit de fijación/permeabilización BD Cytofix/Cytoperm™). Sin embargo, tenga en cuenta que la resolución de las poblaciones positivas y negativas es menor en células fijadas y permeabilizadas que en células vivas. Siempre que sea posible, se recomienda analizar las muestras en vivo.
Avisos del producto: Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Para conocer los espectros de fluorocromos y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web de Citometría de Flujo Multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. Antes de teñir con este reactivo, confirme que su citómetro de flujo sea capaz de excitar el fluorocromo y discriminar la fluorescencia resultante. Consulte los protocolos técnicos en www.bdbiosciences.com/us/s/resources.