BD, 565575, Conjunto de tampones de fosfofactor de transcripción BD Pharmingen™

Estado regulatorio: RUO
Descripción: Descripción La inmunidad protectora depende de respuestas coordinadas entre células T reguladoras y convencionales y otros subconjuntos de leucocitos. Los análisis citométricos de flujo de alta resolución de las respuestas de señalización realizadas por subconjuntos de leucocitos, definidos por sus niveles coexpresados ​​de antígenos de diferenciación de superficie y factores de transcripción específicos, proporcionan conocimientos profundos sobre los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a la regulación inmune en estados sanos y patológicos. Históricamente, las características dispares de compatibilidad de tampones han creado desafíos para el análisis simultáneo de estos biomarcadores coexpresados. El conjunto de tampones BD Pharmingen™ Transcription Factor Phospho (TFP) está diseñado para permitir un análisis citométrico de flujo robusto y simultáneo de varios antígenos de superficie celular, factores de transcripción y proteínas señal fosforiladas en células derivadas de tejidos humanos y de ratón. Esto incluye células mononucleares de sangre periférica humana frescas, fijadas y congeladas. El juego de tampones TFP de BD Pharmingen™ se ha aplicado con éxito al análisis citométrico de flujo multiparamétrico de las respuestas de la señalización Stat fosforilada a citocinas producidas por linfocitos T reguladores humanos y murinos, así como por subgrupos de linfocitos T convencionales, así como por otros tipos de leucocitos definidos por ciertos marcadores de superficie celular, factores de transcripción (FoxP3 y T-bet) y características físicas. Si bien no se conocen todas las compatibilidades de los anticuerpos, las respuestas de la señalización celular a diferentes estímulos también deberían ser susceptibles de análisis utilizando este juego de tampones y anticuerpos específicos para otros marcadores de superficie celular, factores de transcripción y tipos de proteínas de señalización fosforiladas posteriores. Este sistema de tampones es retrocompatible con muchos reactivos de BD, incluyendo anticuerpos conjugados con nuevos colorantes fluorescentes (p. ej., BD Horizon™ BV421, BV510, PE-CF594, V450 y V500). 4X TFP Fix/Perm Buffer - Contiene 15,6% de formaldehído, 5,5% de metanol Indicaciones de peligro Líquido combustible. Nocivo en caso de ingestión o contacto con la piel. Tóxico en caso de inhalación. Provoca irritación cutánea. Provoca lesiones oculares graves. Puede provocar una reacción alérgica en la piel. Se sospecha que provoca defectos genéticos. Puede provocar cáncer. Vía de exposición: Inhalatorio. Puede provocar daños en el sistema nervioso central. Vía de exposición: Oral. Puede causar irritación respiratoria. Consejos de precaución Llevar guantes/protección ocular. Llevar ropa de protección. No respirar la niebla/los vapores/el aerosol. EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Aclarar cuidadosamente con agua durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto, si lleva y resulta fácil. Seguir aclarando. EN CASO DE INHALACIÓN: Transportar a la víctima al exterior y mantenerla en reposo en una posición confortable para respirar. EN CASO DE INGESTIÓN: Llamar a un CENTRO DE TOXICOLOGÍA/médico si se siente mal Perm Buffer III - Contiene 88% de metanol Indicaciones de peligro Líquido y vapores altamente inflamables. Tóxico si se ingiere, en contacto con la piel o si se inhala. Provoca daños en el sistema nervioso central. Vía de exposición: Oral. Consejos de precaución Mantener alejado del calor/chispas/llamas abiertas/superficies calientes. - No fumar. Llevar ropa de protección/protección ocular. Llevar guantes de protección. No respirar la niebla/los vapores/el aerosol. EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL (o el pelo): Quitarse/quitarse inmediatamente toda la ropa contaminada. Aclararse la piel con agua/ducharse. EN CASO DE INHALACIÓN: Transportar a la víctima al exterior y mantenerla en reposo en una posición confortable para respirar.
Procedimientos de ensayo recomendados: Esquema del protocolo de los procedimientos de ensayo recomendados 1. Tratamiento celular: Prepare la suspensión de células individuales y sedimente las células mediante centrifugación. Resuspenda las células en 50-100 μL/prueba de PBS de Dulbecco 1× que contenga Ca++/Mg++ y, a continuación, trate las células (p. ej., con un modificador de respuesta). 2. Fije y permeabilice las células con el juego de tampones BD Pharmingen™ Transcription Factor Phospho (TFP) (n.º de cat. 563239/565575). 3. Lave las células utilizando tampón de permeación/lavado 1× TFP. Sedimente las células mediante centrifugación y aspire los sobrenadantes. No deje sobrenadante residual del tampón. 4. Incube las células con el tampón de permeación III BD Phosflow™, sedimente las células y retire el sobrenadante del tampón de permeación III. 5. Lave las células con tampón de permanganato de potasio (TFP)/lavado 1× y tiña las células con anticuerpos fluorescentes. Lave las células con tampón de permanganato de potasio (TFP)/lavado 1×. 6. Resuspenda las células en tampón de tinción (BSA) BD Pharmingen™ (n.º de cat. 554657) y analice mediante citometría de flujo. Comentarios generales • Todo el protocolo se realiza a 2-8 ºC con dos excepciones: o Durante el tratamiento de células frescas en DPBS 1× con modificador de respuesta o Cuando se utiliza el tampón de permanganato de potasio III que se ha almacenado a -20 ºC. • Enfríe la centrífuga y prepare cócteles de anticuerpos fluorescentes y otras soluciones antes de comenzar el protocolo. • Prepare el tampón de permanganato de potasio (TFP) 1× a partir de la solución madre de tampón de permanganato de potasio (TFP)/lavado 5× diluyéndolo con agua desionizada filtrada. • Además, prepare el tampón de fijación/permanganato de potasio (TFP) 1× 10-15 minutos antes de su uso. Mezcle 4× TFP Fix/Perm Buffer con 0,75× TFP Diluent para preparar 1× TFP Perm/Wash Buffer (p. ej., utilice 10 ml de 4× TFP Fix/Perm Buffer y mézclelos con 30 ml de 0,75× TFP Diluent). • El intervalo de tiempo para teñir las células con anticuerpos probablemente se pueda limitar a 30 min. Sin embargo, el protocolo de tinción original se desarrolló utilizando tiempos de incubación de al menos 40 minutos. • Mantenga la centrífuga a 2-8 °C y mantenga constantes las velocidades de la centrífuga (380 g antes de la fijación celular, 500 g después de la fijación). • No se introduce un tiempo de incubación de permeabilización utilizando el Perm/Wash Buffer. No es necesario. • Este protocolo no está optimizado para su uso con sangre completa. Materiales y equipo • 1× PBS de Dulbecco (DPBS) que contiene Ca++/Mg++ • 1× PBS de Dulbecco (DPBS) que contiene sin Ca++/Mg++ • Juego de tampones de fosfofactor de transcripción BD Pharmingen™ (n.º de cat. 563239/565575) • Tampón de tinción BD Pharmingen™ (BSA) (n.º de cat. 554657) • Tubos de centrífuga cónicos de polipropileno estériles de 50 o 15 ml • Incubadora o baño de agua a 37 ºC • Centrífuga con control de temperatura capaz de 200-600 g y que admite tubos de citometría de flujo, placas de 96 pocillos profundos y tubos cónicos de 15 y 50 ml • Muestras: células mononucleares de sangre periférica (PBMC) 1-2 millones de células por prueba para procesamiento a granel y tubo de citometría de flujo. PBMC 0,75 a 1,0 millones de células por prueba para HTS en placas de pocillos profundos y placas de fondo redondo de 96 pocillos para HTS en el citómetro de flujo • FBS inactivado por calor con solución de congelación DMSO al 7,5 % • Tubos de citometría de flujo o placa de almacenamiento de 2,2 ml, MARK II (96 pocillos profundos; Abgene Cat. No. AB0932) y placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos • Anticuerpos fluorescentes específicos para antígenos intracelulares y de superficie celular • Pipetas multicanal que pueden administrar volúmenes de 20 μL, 200 μL o 1000 μL Tinción de células en tubos 1. Trate las preparaciones celulares (humanas o de ratón) con un modificador de respuesta, como una citocina en dosis subóptimas o saturantes (p. ej., 50-100 unidades por ml) de interés, utilizando una suspensión de 1 ml de 10-20 millones de células (10 pruebas) en 1× DPBS con Ca++/Mg++. Nota: Mantenga este volumen de DPBS bajo, es importante para el efecto deseado del tampón de fijación/permanencia 1× TFP. Use un tubo de centrífuga cónico de polipropileno de 50 mL para el tratamiento celular a granel. 2. Incube 15 min a 37 ºC, exactamente, o use otra condición de tratamiento específica según lo desee. 3. Detenga el tratamiento celular agregando 1× TFP Fix/Perm Buffer a las células. Nota: Agregue lentamente 10 mL de 1× TFP Fix/Perm Buffer (a 2-8 ºC). Tape e invierta los tubos varias veces. 4. Incube durante 50 min a 2-8 ºC para fijar y permeabilizar las células. 5. Agregue 5 ml de 1× TFP Perm/Wash Buffer. 6. Centrifugue las células a 500 g (15 min a 2-8 ºC). 7. Aspire los sobrenadantes de las muestras celulares sedimentadas, lave las células una vez con 10 mL de tampón de permanganato de potasio TFP 1×. 8. Centrifugue las células a 500 g (10 min); aspire todo el volumen residual del sobrenadante de las células sedimentadas. Opción de almacenamiento a largo plazo: después del paso 8, puede resuspender las células en 200-500 μL de FBS con DMSO al 7,5% y congelar a -80 °C en tubos de criopreservación. Descongele retirando las células del congelador, agregando volúmenes iguales de tampón de permanganato de potasio TFP frío y descongele en un baño de agua fría. Lave una vez con tampón de permanganato de potasio TFP y luego continúe con el protocolo desde el paso 9. 9. Agregue 1,0 mL de tampón de permanganato de potasio III (u otro volumen deseado si se hace a granel) por cada 1-2 millones de células Notas: i) El tampón de permanganato de potasio III se toma de un congelador a -20 °C. ii) Los sedimentos celulares se vuelven translúcidos durante este paso. 10. Incubar durante 20 min en hielo para permitir la exposición de los epítopos proteicos fosforilados. Opción n.º 2 de almacenamiento a corto plazo: Conservar durante la noche a 20 ºC. Cubrir los tubos con Parafilm® y protegerlos de la humedad. Continuar con el protocolo al día siguiente. Si se elige almacenar las muestras de esta manera, retirar a 2-8 ºC y dejar calentar durante 5-10 minutos y proceder al paso 11. 11. Centrifugar a 500 g (8 min, a 2-8 ºC) y aspirar cuidadosamente el tampón de permeación III, asegurándose de eliminar todo el volumen residual. 12. Lavar una vez con tampón de permeación/lavado TFP 1×. Utilizar 10 ml si se utilizan tubos cónicos de 50 ml a granel o 2 ml si se utilizan tubos de citometría de flujo; eliminar todo el tampón residual del pellet celular después de la centrifugación. Añadir 80-90 μl de tampón de permeación/lavado TFP 1× por prueba y resuspender los pellets celulares como preparación para la tinción. Opcional: repita el paso de lavado para asegurarse de eliminar todo el Perm Buffer III. Si no se lava bien el metanol antes de la tinción, se pueden destruir los fluorocromos de proteínas y los colorantes en tándem (p. ej., PerCP, PE, PE-Cy™7). 13. Tinción con anticuerpos fluorescentes: en este momento, puede ser necesario o deseable tomar alícuotas de las muestras de células en tubos de citometría de flujo para teñirlas con diferentes paneles de anticuerpos fluorescentes. a. Tinción intracelular: agregue anticuerpos específicos para antígenos diana intracelulares como FoxP3, T-bet, proteínas Stat fosforiladas u otras moléculas intracelulares según se desee. Nota: se sabe que al teñir células en TFP Perm/Wash Buffer, se necesitan concentraciones más bajas de anticuerpos para la tinción intracelular, p. ej., tamaño de prueba de 0,5× o 0,25× (normalmente 2,5 µL de un tamaño de prueba de 5 µL). Sin embargo, los anticuerpos fluorescentes específicos para las proteínas Stat fosforiladas deben usarse en el tamaño de prueba indicado en el vial. Nota: Al teñir FoxP3 humano, se recomienda el clon de anticuerpo 236A para obtener mejores resultados. b. Tinción de moléculas de superficie: Prepare un cóctel de anticuerpos fluorescentes específicos para teñir antígenos de superficie celular en tampón de permeación/lavado 1× TFP o tampón de tinción (BSA). Por ejemplo, diluya los anticuerpos de superficie fluorescentes a una dilución de 10 µL:1000 µL para hacer un cóctel de 50 pruebas a 20 µL por prueba. 14. Incubar durante 40-50 min a 2-8 °C 15. Lave las células una vez con 2 mL de tampón de permeación/lavado 1× TFP, centrifugue las suspensiones celulares a 500 g durante 5 min a 2-8 °C y aspire los sobrenadantes de las células sedimentadas. 16 . Resuspenda las células en 350 μL de tampón de tinción (n.° de cat. 554657). Nota: ¡No resuspenda las células en tampón de permeación/lavado TFP 1×! 17. Adquiera un número suficiente de eventos mediante citometría de flujo para obtener resultados estadísticamente significativos, por ejemplo, ≥ 15 000 CD4+ o ≥ 150 eventos FoxP3+, según corresponda. Debido al procedimiento de fijación y permeabilización, las señales de dispersión de luz frontal y lateral pueden ser ligeramente diferentes a las de las células vivas. Tinción de células en placas de 96 pocillos Utilice una placa de almacenamiento de 2,2 mL, MARK II (96 pocillos profundos; Abgene Cat. No. AB0932) y placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos 1. Trate las preparaciones celulares (humanas o de ratón) con modificadores de respuesta (como se indicó anteriormente) en una placa de 96 pocillos profundos utilizando células a 0,5-1,0 millones de células/pocillo en 1× DPBS con Ca++/Mg++. Por ejemplo: comience con 50 μL de células a 10-20 millones de células/mL (0,5-1 millón de células/pocillo) y agregue 20 μL de modificador de respuesta (diluido en DPBS + 1 mg/mL de BSA), para un volumen final de células + modificador de respuesta de 70 μL. 2. Incube 15 min a 37 ºC, exactamente, o use otra condición de tratamiento específica según se desee. 3. Detenga el tratamiento celular añadiendo 1x TFP Fix/Perm Buffer a las células. Utilice una pipeta multicanal de 1,2 mL para añadir 1,0 mL de 1x TFP Fix/Perm Buffer frío. Mezcle bien pipeteando arriba y abajo varias veces. 4. Incube durante 50 min a 2-8 °C para fijar y permeabilizar las células. 5. Añada 350 μL de 1x TFP Perm/Wash Buffer a cada pocillo. 6. Centrifugue las células a 500 g durante 8 min a 2-8 °C. 7. Aspire los sobrenadantes de las muestras y lave las células una vez con 700 μL de 1x TFP Perm/Wash Buffer. 8. Centrifugue las células a 500 g durante 8 min y aspire todo el volumen residual del sobrenadante de las células sedimentadas. Opción de almacenamiento a largo plazo: Después del paso 8, resuspenda las células en cada pocillo con 200-500 μL de FBS con 7,5% de DMSO y congele a -80 °C. Descongele retirando las células del congelador, añadiendo 1 mL de tampón de permeación/lavado TFP frío y descongelando la placa en un baño de agua fría. Lave las células con tampón de permeación/lavado TFP una vez más y luego proceda con el protocolo desde el paso 9. 9. Antes de añadir cualquier tampón a la placa, agite en vórtex para resuspender las células. Añada 500 μL de tampón de permeación III por pocillo y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Notas: i) El tampón de permeación III se toma del congelador a -20 °C antes de su uso. ii) Los pellets celulares se vuelven translúcidos durante este paso. 10. Incube durante 20 min en hielo para permitir la exposición de los epítopos fosforilados. Opción de almacenamiento a corto plazo: Almacene durante la noche a -20 °C. Cubra la placa con una tapa, asegúrela con Parafilm® y protéjala de la humedad. Continúe con el protocolo al día siguiente. Si elige almacenar las muestras de esta manera, retire la placa a 2-8 ºC y deje que se caliente durante 5-10 minutos y proceda al paso 11. 11. Centrifugue las células a 500 g durante 8 min a 2-8 ºC, aspire cuidadosamente el sobrenadante del Perm Buffer III de las células sedimentadas. 12. Lave una vez con 1× TFP Perm/Wash Buffer, 1 mL por pocillo y centrifugue; elimine todo el tampón residual. Opcional: repita el paso de lavado para asegurarse de eliminar todo el Perm Buffer III. Si no se lava bien el metanol antes de la tinción, se puede destruir el fluorocromo de proteína y los colorantes en tándem (p. ej., PE, PerCP, PE-Cy™7, etc.). Resuspenda las células en 100 μL de 1× TFP Perm/Wash Buffer. 13. Tinción con anticuerpos fluorescentes: a. Tinción intracelular: agregue anticuerpos específicos para antígenos diana intracelulares como FoxP3, T-bet, proteínas Stat fosforiladas u otras moléculas intracelulares según se desee. Nota: Se sabe que cuando se tiñen células en tampón de lavado/permeabilización TFP, se necesitan concentraciones más bajas de anticuerpos para la tinción intracelular, p. ej., tamaño de prueba 0,5× o 0,25× (normalmente 2,5 µL de un tamaño de prueba de 5 µL). Sin embargo, los anticuerpos fluorescentes específicos para proteínas Stat fosforiladas se deben usar en el tamaño de prueba indicado en el vial. Nota: Cuando se tiñe FoxP3 humano, se recomienda el clon de anticuerpo 236A para obtener mejores resultados. b. Tinción de moléculas de superficie: prepare un cóctel de anticuerpos fluorescentes específicos para teñir antígenos de superficie celular en tampón de lavado/permeabilización TFP 1× o tampón de tinción (BSA). Por ejemplo, diluya los anticuerpos fluorescentes de superficie a una dilución de 10 µL:1000 µL para preparar un cóctel de 50 pruebas a 20 µL por prueba. Añada este volumen de prueba al tubo después de añadir los anticuerpos intracelulares. 14. Incube durante 40-50 min a 2-8 °C. 15. Lave las células una o dos veces con 200 µL de tampón de lavado/permeabilización TFP, centrifugue a 500 g durante 5 min a 2-8 °C; aspire cuidadosamente los sobrenadantes de la muestra. Transfiera las células a placas estándar de 96 pocillos de fondo redondo para la adquisición. 16. Resuspenda las células sedimentadas en 200 µL de tampón de tinción (BSA) (n.º de cat. 554657). Nota: ¡no resuspenda en tampón de lavado/permeabilización TFP 1×! 17. Adquirir un número suficiente de eventos para obtener resultados estadísticamente significativos, p. ej., ≥ 15 000 CD4+ o ≥ 150 eventos FoxP3+, según corresponda. Anticuerpos probados como compatibles para tinción con el conjunto de tampones de fosfofactor de transcripción BD Pharmingen™. Descripción: Clon. Reactividad. Formatos probados. Cat. No. CD3 SK7 Hu PE 340662 CD3 UCHT1 Hu PerCP-Cy5.5, 560835, 562427, 560365 BD Horizon™ BV421 y V450 CD4 SK3 Hu BV510, PerCP-Cy5.5 562970, 562971, 560650 CD20 HI (FB1) Hu Alexa Fluor® 700 561171 CD21 B-ly4 Hu APC 559867 CD25 2A3, MA251 Hu PE, BD Horizon™ BV421 564033, 557138, 341010, 564033, 562442 CD45RA HI100 Hu PE-Cy™7 560675 CD3 17A2 Sra. APC-Cy™7, BV421 560590, 564008 CD4 RM4-5 Sra. PerCP-Cy5.5 553050 CD25 3C7 Sra. BV421 564370 Stat1 (pY701) 4a Hu, Sra. Alexa Fluor® 647 612597 Stat3 (pY705) 4/P-STAT3 Hu, Sra. Alexa Fluor® 647 557815 Stat4 (pY693) 38/p-Stat4 Hu, Sra. Alexa Fluor® 647 558137 Stat5 (pY694) 47/Stat5(pY694) Hu, Sra. Alexa Fluor® 647 562076, 612599 Stat6 (pY641) 23/Stat6, 18/P-Stat6 Hu, Sra. Alexa Fluor® 647 560000, 612601 CD247, CD3 Zeta (pY142) K25-407.69 Hu Alexa Fluor® 647 558489 ZAP-70 (PY319)/Syk (PY352) 17A/P-ZAP70 Hu Alexa Fluor® 647 557817 SLP-76 (pY128) H3 Hu Alexa Fluor® 647 560057 AKT (pS473) M8961 Hu Alexa Fluor® 647 560343 LAT (pY171) 158-1169 Hu Alexa Fluor® 647 559518 ERK 1/2 (pT202/pY204) 20A Hu Alexa Fluor® 647 561992 Ki-67 B56 Hu Alexa Fluor® 647 561126 FOXP3 259D/C7 Hu Alexa Fluor® 488, PE 560047, 560046 FOXP3 236A/E7 Hu Alexa Fluor® 488, PE 561181, 560852 FOXP3 MF23 Ms Alexa Fluor® 488, PE 560407, 561181 T-bet O4-46 Hu, Ms PE, PE-CF594 561268, 562467 GATA3 L50-823 Hu PE 560074 EZH2 PE 11/EZH2 Hu PE 562478 IMC-1 P51-311 Hu PE 562528 Pax-5 1H9 Hu PE 562688 Tinción de viabilidad fijable 450 N/D Hu BD Horizon™ V450 562247 Todos los formatos de los anticuerpos mencionados se probaron y se demostró su eficacia en la tinción celular con el juego de tampones de fosfofactor de transcripción BD Pharmingen™. Es probable que este tampón funcione con otros formatos de los mismos clones, así como con otros anticuerpos. Sin embargo, no se han probado. Mostrar menos
Avisos del producto: Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para conocer los protocolos técnicos. Alexa Fluor® es una marca registrada de Molecular Probes, Inc., Eugene, OR. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Cy es una marca registrada de GE Healthcare. Mostrar menos
Descripción: Cantidad/Tamaño: Número de pieza: ID de EntrezGene
N/D : 7.5 : N/D : N/D