BD, 565694, Tinción de viabilidad reparable BD Horizon™ 575V

Aplicación: Citometría de flujo, tinción intracelular (citometría de flujo) (probado durante el desarrollo)
ID de registro: AB_2869702
Estado regulatorio: RUO
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Preparación Lleve el polvo de colorante FVS575V y 340 μL de dimetilsulfóxido (DMSO; p. ej., Sigma D2650) fresco de grado de cultivo celular a temperatura ambiente. Agregue 340 μL de DMSO; agite bien la solución. Inspeccione la solución y repita el agitado hasta que el colorante madre se haya disuelto completamente. Esta es la solución madre. Almacenamiento Al llegar, almacene el colorante seco desecado y protegido de la luz a -80 °C hasta su uso. Después de la reconstitución con DMSO, almacene la solución madre a -20 °C en pequeñas alícuotas. No use el colorante reconstituido después de 90 días de almacenamiento. Deseche la solución de colorante después de 90 días posteriores a la reconstitución con DMSO. Requisitos de citometría Se pueden usar citómetros de flujo equipados con láser violeta (p. ej., BD FACSCanto™ II, BD LSRFortessa™ o BD™ LSR II). Tenga en cuenta que FVS575V también se excita con el láser UV. Este colorante se puede leer en filtros comúnmente utilizados para BD Horizon Brilliant Violet 605 (p. ej., 610/20) o Pacific Orange (p. ej., 575/20). La compensación de fluorescencia se logra mejor utilizando una muestra de las células de interés. Al diseñar paneles de reactivos de tinción multicolor, tenga en cuenta el derrame en el canal BD Horizon BV510. Los paneles se deben optimizar para tener en cuenta este derrame. Recomendamos titular el colorante y utilizar la concentración más baja posible que proporcione una resolución adecuada de las poblaciones vivas y muertas para el tipo de célula de interés para reducir el derrame. Procedimiento Marcaje de células con tinción de viabilidad fijable 575V 1. Prepare las células para la tinción de citometría de flujo utilizando tampones sin azida sódica. 2. Lave las células una vez en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (1× DPBS) sin azida sódica ni proteínas. 3. Resuspenda las células a una concentración de 1-10×10^6 células/ml en DPBS 1× sin azida sódica ni proteínas. 4. Añada 1 μL de la solución madre BD Horizon Fixable Viability Stain 575V por cada ml de suspensión celular (1:1000) y agite inmediatamente. a. Nota: Recomendamos titular el colorante para un rendimiento óptimo, ya que los diferentes tipos de células y aplicaciones pueden dar lugar a una amplia variabilidad en la tinción. 5. Incube la mezcla durante 10-15 minutos a temperatura ambiente protegida de la luz. a. Opcional: Como alternativa, incube las mezclas a 37 °C durante 5-7 minutos o a 2-8 °C durante 30-60 minutos. 6. Lave las células dos veces con 2 ml de tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS) (n.º de cat. 554656) o equivalente. 7. Decante el sobrenadante y mezcle suavemente para romper el sedimento celular. 8. Resuspenda las células en tampón de tinción (FBS) o equivalente. 9. Tiña, fije y permeabilice las células según se desee para aplicaciones posteriores. Notas: 1. Cada usuario debe determinar las concentraciones óptimas de reactivos, células y condiciones para el ensayo de interés. Recomendamos titular el reactivo en los primeros experimentos para obtener resultados óptimos. 2. La reactividad del colorante libre se neutraliza lavando con tampón que contenga proteína (p. ej., FBS o BSA). 3. Las células pueden teñirse en bloque antes de congelarlas o teñirlas con anticuerpos fluorescentes. 4. BD Horizon Fixable Viability Stain 575V se puede utilizar en ensayos de tinción intracelular que requieren fijación con formaldehído y permeabilización con metanol y detergentes como los utilizados para la tinción BD Phosflow™ (p. ej., n.º de cat. 558050, BD Phosflow Perm Buffer III), tinción intracelular de citocinas (p. ej., n.º de cat. 554714, BD Cytofix/Cytoperm™ Fixation/Permeablization Kit) o ​​tinción de factores de transcripción (p. ej., n.º de cat. 562574, BD Pharmingen Transcription Factor Buffer Set). 5. Las células apoptóticas pueden mostrar una tinción variable. Recomendamos la tinción conjunta con, por ejemplo, Annexin V APC (Cat. No. 550475) o Alexa Fluor® 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 (Cat. No. 560626) si se desea realizar un análisis más detallado de las células apoptóticas.
Avisos del producto: Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Para conocer los espectros de fluorocromos y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web de citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. Alexa Fluor® es una marca registrada de Molecular Probes, Inc., Eugene, OR. Antes de teñir con este reactivo, confirme que su citómetro de flujo sea capaz de excitar el fluorocromo y discriminar la fluorescencia resultante. Consulte http://regdocs.bd.com para acceder a las fichas de datos de seguridad (FDS). Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos.