BD, 565878, BD Pharmingen™ Fluo-4 AM

Aplicación: Citometría de flujo (probada durante el desarrollo)
ID de registro: AB_2869724
Estado regulatorio: RUO
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Preparación Lleve el polvo de colorante Fluo-4 AM y el dimetilsulfóxido anhidro a temperatura ambiente. Añada 9 μl de DMSO al polvo de colorante y agite bien la solución. Inspeccione la solución y repita el agite hasta que el colorante madre se haya disuelto completamente. Esto produce una solución madre de 5 mM. Almacenamiento A la llegada, almacene el colorante seco desecado y protegido de la luz a -20 °C hasta su uso. Recomendamos utilizar un vial nuevo de colorante para cada experimento y que el colorante reconstituido se deseche después de su uso. Sin embargo, si se van a conservar las soluciones madre para su uso, deben almacenarse desecada y protegida de la luz a -20 °C y usarse dentro de una semana de la reconstitución. Requisitos de citometría Se pueden utilizar citómetros de flujo equipados con láser azul (p. ej., 488 nm) (p. ej., BD Accuri™ C6, BD LSRFortessa™, BD LSRFortessa™ X-20 o BD™ LSR II). Este colorante se puede leer en filtros comúnmente utilizados para FITC o Alexa Fluor® 488 (p. ej., 530/30). La compensación de fluorescencia se logra mejor utilizando una muestra de las células de interés teñidas con el colorante. Al diseñar paneles multicolor, tenga en cuenta el derrame en los canales PE y BD Horizon™ PE-CF594 en el láser azul. Si está disponible, la recolección de estos fluorocromos utilizando el láser amarillo-verde (p. ej., 561 nm) puede ser ventajosa para evitar el derrame de Fluo-4 AM. Los paneles deben optimizarse para tener en cuenta este derrame. Procedimiento BD Pharmingen™ Fluo-4 AM Marcaje de Células 1. Prepare una suspensión de células individuales a 1×10e6 células/mL en el tampón de carga fisiológica de elección. • Si se usa suero en el tampón de carga, debe inactivarse por calor para evitar que la actividad residual de la esterasa sérica escinda las fracciones AM en el colorante antes de la entrada en las células. 2. Agregue la solución madre del colorante para una concentración de tinción final de 1 - 5 μM y agite en vórtex inmediatamente. • Recomendamos usar la concentración más baja de colorante que aún produzca suficiente señal para evitar la toxicidad del colorante, la compartimentación y el tampón de calcio. 3. Incubar de 15 a 60 minutos a 37 °C. • Se ha informado que la compartimentación del colorante es menos significativa a temperaturas de carga más bajas. En este caso, puede ser ventajoso cargar las células a temperatura ambiente si la compartimentación del colorante es significativa para el tipo de célula de interés. 4. Lave una vez y resuspenda en el tampón de análisis de elección. • Para algunos tipos celulares, puede ser ventajoso incubar las células durante 30 minutos más para permitir la desesterificación completa de las fracciones de AM. En este caso, las células deben incubarse en el tampón fisiológico de elección o en un medio completo, lavarse una vez más y luego resuspenderse en el tampón de análisis de elección. 5. Proceder a la citometría de flujo.
Avisos del producto: Alexa Fluor® es una marca registrada de Molecular Probes, Inc., Eugene, OR. Antes de teñir con este reactivo, confirme que su citómetro de flujo pueda excitar el fluorocromo y discriminar la fluorescencia resultante. Para conocer los espectros de fluorocromo y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web sobre citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. Para conocer los protocolos técnicos, visite www.bdbiosciences.com/us/s/resources. Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos.