BD, 565879, BD Pharmingen™ Indo-1 AM

Aplicación: Citometría de flujo (probada durante el desarrollo)
ID de registro: AB_2869725
Estado regulatorio: RUO
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Preparación Lleve el polvo de colorante Indo-1 AM y el dimetilsulfóxido anhidro a temperatura ambiente. Añada 10 μL de DMSO al polvo de colorante y agite bien la solución. Inspeccione la solución y repita el agitado hasta que el colorante madre se haya disuelto completamente. Esto produce una solución madre de 5 mM. Almacenamiento A la llegada, guarde el colorante seco desecado y protegido de la luz a -20 °C hasta su uso. Recomendamos que se utilice un vial nuevo de colorante para cada experimento y que el colorante reconstituido se deseche después de su uso. Sin embargo, si se van a conservar las soluciones madre para su uso, deben almacenarse desecada y protegida de la luz a -20 °C y usarse en el plazo de una semana desde su reconstitución. Requisitos de citometría Se pueden utilizar citómetros de flujo equipados con láser UV (355 nm) (p. ej., BD LSRFortessa™, BD LSRFortessa™ X-20 o BD™ LSR II). Este colorante es raciométrico y requiere conjuntos de filtros de alrededor de 400 nm (ligado a calcio) y 500 nm (libre de calcio). Los conjuntos de filtros para BUV395 (p. ej., 379/28) y BUV496 (p. ej., 515/30) junto con un espejo dicroico de 450 nm entre los conjuntos de filtros funcionan bien. Los cambios raciométricos en la concentración de calcio se calculan generalmente como la relación de la emisión en el filtro de longitud de onda baja a la emisión en el filtro de longitud de onda alta. La compensación de fluorescencia se logra mejor utilizando una muestra de las células de interés teñidas con el colorante. Al diseñar paneles multicolor, tenga en cuenta el derrame en los canales BD Horizon™ BV421 y BD Horizon BV510. Los paneles se deben optimizar para tener en cuenta este derrame. Procedimiento BD Pharmingen™ Indo-1 AM Marcaje de células 1. Prepare una suspensión de células individuales a 1 × 10e6 células/ml en el tampón de carga fisiológica de elección. a. Si se usa suero en el tampón de carga, debe inactivarse por calor para evitar que la actividad residual de la esterasa sérica escinda las fracciones de AM en el colorante antes de que entren en las células. 2. Agregue la solución madre del colorante para una concentración de tinción final de 1-10 μM y agite en vórtex inmediatamente. a. Recomendamos usar la concentración de colorante más baja que aún produzca suficiente señal para evitar la toxicidad del colorante, la compartimentación y el tampón de calcio. 3. Incubar de 15 a 60 minutos a 37 °C. a. Se ha informado que la compartimentación del colorante es menos significativa a temperaturas de carga más bajas. En este caso, puede ser ventajoso cargar las células a temperatura ambiente si la compartimentación del colorante es significativa para el tipo de célula de interés. 4. Lavar una vez y resuspender en el tampón de análisis de elección. a. Para algunos tipos de células, puede ser ventajoso permitir que las células se recuperen durante otros 30 a 60 minutos para permitir la desesterificación completa de las fracciones de AM. En este caso, las células deben incubarse en el tampón fisiológico de elección o en medio completo, lavarse una vez más y luego resuspenderse en el tampón de análisis de elección. 5. Proceder a la citometría de flujo. a. Los usuarios de BD FACSDiva™ pueden crear un parámetro raciométrico antes de la adquisición en la pestaña Ratio del menú Citómetro. Este parámetro no se puede editar durante la adquisición. Por lo tanto, puede ser útil crear controles (p. ej., una muestra de control que se estimulará con el ionóforo A23187 o ionomicina) para ajustar la escala del parámetro raciométrico con antelación a fin de garantizar que los valores raciométricos estén en escala. b. Alternativamente, se pueden adquirir datos para cada parámetro no raciométrico individualmente y luego se puede calcular el parámetro raciométrico a partir de los datos sin procesar en FlowJo™ (FlowJo, LLC) como un Parámetro Derivado. Nota: Antes de teñir con este reactivo, confirme que su citómetro de flujo es capaz de excitar el fluorocromo y discriminar la fluorescencia resultante.
Avisos del producto: Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Consulte los protocolos técnicos en www.bdbiosciences.com/us/s/resources. Para obtener información sobre los espectros de fluorocromos y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web sobre citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors.