BD, 566332, Tinción de viabilidad reparable BD Horizon™ 440UV

Aplicación: Citometría de flujo, tinción intracelular (citometría de flujo) (probado durante el desarrollo)
ID de registro: AB_2869748
Estado regulatorio: RUO
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Preparación Lleve el polvo de colorante FVS440UV y 363 μl de dimetilsulfóxido (DMSO; p. ej., Sigma D2650) fresco de grado de cultivo celular a temperatura ambiente. Agregue 363 μl de DMSO y agite bien la solución. Inspeccione la solución y repita el agitado hasta que el colorante madre se haya disuelto completamente. Esta es la solución madre. Almacenamiento Al llegar, almacene el colorante seco desecado y protegido de la luz a -80 °C hasta su uso. Después de la reconstitución con DMSO, almacene la solución madre a -20 °C en pequeñas alícuotas. No use el colorante reconstituido después de 90 días de almacenamiento. Deseche la solución de colorante después de 90 días posteriores a la reconstitución con DMSO. Requisitos de citometría Se pueden usar citómetros de flujo equipados con láser UV (p. ej., BD LSRFortessa™, BD LSRFortessa™ X-20 o BD™ LSR II). Este colorante se puede leer en filtros comúnmente utilizados para colorantes DAPI o Hoechst (p. ej., 450/50). También es compatible con conjuntos de filtros diseñados para BD Horizon™ BUV395 (p. ej., 379/28), aunque puede ser necesario usar más colorante para lograr la misma resolución. Consulte "Procedimiento" para obtener más información. La compensación de fluorescencia se logra mejor utilizando una muestra de las células de interés teñidas con FVS440UV. Al diseñar paneles multicolor, tenga en cuenta el derrame en los canales BD Horizon™ BV421 y APC. Los paneles deben optimizarse para tener en cuenta este derrame. Recomendamos titular el colorante y usar la concentración más baja posible que proporcione una resolución adecuada de las poblaciones vivas y muertas para el tipo de célula de interés para reducir el derrame. Procedimiento: Tinción de viabilidad fijable. Marcaje de células con 440UV. 1. Prepare las células para la tinción de citometría de flujo utilizando tampones sin azida sódica. 2. Lave las células una vez en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS 1×) sin azida sódica ni proteínas. 3. Resuspenda las células a una concentración de 1-10 × 10^6 células/ml en DPBS 1× sin azida sódica ni proteínas. 4. Añada 1 µl de solución madre BD Horizon™ Fixable Viability Stain 440UV por cada 1 ml de suspensión celular (1:1000) y agite inmediatamente con vórtex. a. Nota: Recomendamos titular el colorante para un rendimiento óptimo, ya que los diferentes tipos de células y las diferentes aplicaciones pueden dar lugar a un amplio grado de variabilidad en la tinción. b. Nota: Si el colorante se va a analizar utilizando un juego de filtros BD Horizon BUV395 (p. ej., filtro de paso de banda 379/28), recomendamos utilizar al menos de 2 a 4 µl por 1 ml de suspensión celular como punto de partida para la titulación. 5. Incubar la mezcla durante 10-15 minutos a temperatura ambiente protegida de la luz. a. Opcional: Como alternativa, incubar las mezclas a 37 °C durante 5-7 minutos o a 2-8 °C durante 30-60 minutos. 6. Lavar las células dos veces con 2 ml de tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS) (n.º de cat. 554656) o equivalente. 7. Decante el sobrenadante y mezcle suavemente para romper el sedimento celular. 8. Resuspender las células en tampón de tinción (FBS) o equivalente. 9. Teñir, fijar y permeabilizar las células según se desee para aplicaciones posteriores. Notas: 1. Cada usuario debe determinar las concentraciones óptimas de reactivos, células y condiciones para el ensayo de interés. Recomendamos titular el reactivo en los primeros experimentos para obtener resultados óptimos. 2. La reactividad del colorante libre se extingue lavando con tampón que contiene proteína (p. ej., FBS o BSA). 3. Las células pueden teñirse en masa antes de congelarlas o teñirlas con anticuerpos fluorescentes. 4. BD Horizon™ Fixable Viability Stain 440UV se puede usar en ensayos de tinción intracelular que requieren fijación con formaldehído y permeabilización con metanol y detergentes como los que se usan para la tinción con BD Phosflow™ (p. ej., BD Phosflow™ Perm Buffer III, n.º de cat. 558050), tinción intracelular de citocinas (p. ej., BD Cytofix/Cytoperm™ Fixation/Permeablization Kit, n.º de cat. 554714) o tinción de factores de transcripción (p. ej., BD Pharmingen™ Transcription Factor Buffer Set, n.º de cat. 562574). 5. Las células apoptóticas pueden mostrar una tinción variable. Recomendamos la tinción conjunta con, por ejemplo, Annexin V FITC (Cat. No. 556419) o Alexa Fluor® 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 (Cat. No. 560626) si se desea realizar un análisis más detallado de las células apoptóticas.
Avisos del producto: Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Para conocer los espectros de fluorocromos y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web de Citometría de Flujo Multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. Antes de teñir con este reactivo, confirme que su citómetro de flujo sea capaz de excitar el fluorocromo y discriminar la fluorescencia resultante. Consulte los protocolos técnicos en www.bdbiosciences.com/us/s/resources.