BD, 566385, Tampón de tinción brillante BD Horizon™ Plus

Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C y protegido de la luz. No congelar.
Procedimientos de ensayo recomendados: Protocolos de procedimientos de ensayo recomendados para tinción inmunofluorescente multicolor de células utilizando BD Horizon Brilliant Stain Buffer Plus Tinción de superficie multicolor de muestras de células humanas en tubos o placas de 96 pocillos utilizando reactivos de tinción individuales 1. Agregue 10 μL de BD Horizon Brilliant Stain Buffer Plus a todos los tubos o pocillos deseados para el experimento Nota: La cantidad de 10 μL de Brilliant Stain Buffer Plus por tubo o por pocillo no depende del volumen de tinción final o la cantidad de células utilizadas por tubo o el número de anticuerpos fluorescentes BD utilizados en la tinción. Aunque escritos para su uso con células humanas, estos protocolos se pueden adaptar fácilmente para analizar células de ratón o células de otras especies, por ejemplo, tiñendo células de ratón a 4 °C en lugar de a temperatura ambiente (TA). 2. Agregue cada reactivo fluorescente en el volumen recomendado por prueba (por ejemplo, 5 μL o 20 μL). Proceda al Protocolo 1, 2 o 3. Nota: Si el volumen total de la mezcla de los pasos 1 y 2 no cumple o excede los 50 μL por prueba, aumente el volumen total hasta 50 uL agregando BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS) (N.º de cat. 554656). Protocolo 1 para teñir muestras de sangre completa en tubos a. Agregue 100 μL de sangre completa humana a cada tubo b. Agite el contenido del tubo c. Incube (30 min) las células suspendidas protegidas de la luz a temperatura ambiente (TA) d. Agregue 2 mL de BD FACS™ Lysing Solution (N.º de cat. 349202; 10 min) o BD Pharm Lyse™ Lysing Buffer (N.º de cat. 555899; 15 min) por tubo e incube protegido de la luz a TA e. Sedimente las células por centrifugación (5 min) a 1400-1500 rpm f. Aspire el sobrenadante; agregue 2-3 mL de tampón de tinción/lavado, p. ej., tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS) (n.º de cat. 554656) o tampón de tinción BD Pharmingen™ (BSA) (n.º de cat. 554657) g. Sedimente las células por centrifugación (5 min) a 1400-1500 rpm h. Aspire el sobrenadante y resuspenda las células en 500 μL de tampón de tinción/lavado para el análisis de citometría de flujo Protocolo 2 para tinción de células mononucleares de sangre periférica o muestras de sangre completa lisada por eritrocitos a granel en tubos a. Agregue 100 μL de células humanas a cada tubo b. Agite el contenido del tubo en vórtex c. Incubar (30 min) las células suspendidas protegidas de la luz a temperatura ambiente (TA) d. Añadir 2 ml de tampón de tinción/lavado por tubo e. Sedimentar las células por centrifugación (5 min) a 1400-1500 rpm f. Aspirar el sobrenadante; añadir 2-3 ml de tampón de tinción/lavado g. Sedimentar las células por centrifugación (5 min) a 1400-1500 rpm h. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 500 μL de tampón de tinción/lavado para el análisis de citometría de flujo Protocolo 3 para la tinción de células mononucleares de sangre periférica o muestras de sangre completa lisada con eritrocitos a granel en placas de 96 pocillos Nota: Aunque escrito para su uso con células humanas, este protocolo basado en placas de 96 pocillos puede adaptarse fácilmente para analizar células de ratón o células de otras especies. a. Añadir 50 μL de células humanas a cada pocillo b. Incubar (30 min) protegido de la luz a TA c. Lavar añadiendo 100 μL de tampón de tinción/lavado d. Sedimentar las células mediante centrifugación (5 min) a 1400-1500 rpm e. Aspirar el sobrenadante f. Resuspender las células sedimentadas añadiendo 250 μL de tampón de tinción/lavado g. Sedimentar las células mediante centrifugación (5 min) a 1400-1500 rpm h. Aspirar el sobrenadante i. Resuspender completamente las células sedimentadas con 150 μL de tampón de tinción/lavado pipeteando las células suspendidas varias veces j. Transferir el contenido de los pocillos a los tubos y añadir tampón de tinción/lavado adicional a los tubos según se desee para el análisis de citometría de flujo Nota: Como alternativa, adquirir muestras para el análisis de citometría de flujo directamente de la placa. Tinción intracelular multicolor de muestras de células en tubos o placas de 96 pocillos utilizando reactivos de tinción individuales 1. Añadir 10 μL de BD Horizon Brilliant Stain Buffer Plus a todos los tubos o pocillos deseados para el experimento. Nota: La cantidad de 10 μL de Brilliant Stain Buffer Plus por tubo o por pocillo no depende del volumen de tinción final ni de la cantidad de células utilizadas por tubo ni del número de anticuerpos fluorescentes BD utilizados en la tinción. 2. Añada cada reactivo fluorescente al volumen recomendado por prueba (p. ej., 5 μL o 20 μL). Nota: Si el volumen total de la mezcla de los pasos 1 y 2 no cumple o supera los 50 uL por prueba, aumente el volumen total a 50 uL añadiendo BD Pharmingen Stain Buffer (FBS). Para protocolos de tinción intracelular que deben mantener las células permeabilizadas durante la tinción, utilice BD Perm/Wash™ Buffer (n.º de cat. 554723). Protocolo 4 para tinción de dianas intracelulares en tubos o placas de 96 pocillos Nota: Para la tinción de la superficie primaria, siga los protocolos 1-3 anteriores según corresponda. Si el protocolo intracelular requiere el uso de BD Perm/Wash Buffer durante los pasos de tinción y lavado, use BD Perm/Wash Buffer en los pasos b, e y h; de lo contrario, use BD Pharmingen Stain Buffer (FBS). a. Permeabilice las células según el protocolo de permeabilización deseado. b. Agregue 50 µL de tampón de tinción apropiado. c. Agregue un volumen de prueba de la mezcla de los pasos 1 y 2 (reactivos de tinción más BD Horizon Brilliant Stain Buffer Plus). d. Incube a 4 °C durante 30-60 minutos en la oscuridad. e. Lave con el tampón de lavado apropiado (1 ml/lavado para tinción en tubos y 250 µl/volumen final de lavado para tinción en microplacas). f. Sedimente las células por centrifugación (5 min) a 1400-1500 rpm. g. Aspire el sobrenadante. h. Lavar con el tampón de lavado adecuado (1 ml/lavado para la tinción en tubos y 250 µl/volumen final de lavado para la tinción en placas de micropocillos). i. Sedimentar las células mediante centrifugación (5 min) a 1400-1500 rpm. j. Resuspender en tampón de tinción BD Pharmingen (FBS) antes del análisis por citometría de flujo. Tinción multicolor de muestras de células humanas en tubos o placas de 96 pocillos utilizando reactivos de tinción combinados. En lugar de añadir reactivos de tinción individualmente a cada tubo o pocillo de una placa de 96 pocillos, puede ser conveniente añadir reactivos de tinción combinados, es decir, mezclas de dos o más reactivos de tinción fluorescentes. El siguiente protocolo proporciona un ejemplo de cómo preparar un cóctel de anticuerpos fluorescentes de 5 colores "por prueba" que ya contiene tampón de tinción BD Horizon Brilliant Plus. Muestras humanas: cócteles de reactivos fluorescentes premezclados Para cada prueba multicolor de reactivos fluorescentes combinados: i) Agregar 10 μL de BD Horizon Brilliant Stain Buffer Plus por prueba ii) Agregar cada reactivo fluorescente en el volumen recomendado por prueba (5 μL o 20 μL) iii) Agregar BD Pharmingen Stain Buffer (FBS) (N.º de cat. 554656) para llevar el volumen de cada prueba a un mínimo de 50 μL iv) Mezclar los reactivos (especialmente después de agregar reactivos BD Horizon Brilliant) v) Almacenar el cóctel a 4 °C protegido de la luz si se va a usar más tarde Nota: Protegidos de la luz, los cócteles de reactivos fluorescentes que contienen más de un reactivo violeta brillante y/o azul brillante se utilizan mejor dentro de las 24 horas posteriores a la preparación cuando se almacenan a 4 °C o dentro de las 4 horas cuando se almacenan a temperatura ambiente. Sin embargo, si el cóctel contiene más de un reactivo Ultravioleta Brillante (BUV), se recomienda utilizarlo dentro de las 2 horas posteriores a su preparación, independientemente de la temperatura de almacenamiento. Para obtener más información, consulte la Tabla 1 "Ejemplo de creación de un cóctel de anticuerpos fluorescentes de 5 colores con 2 conjugados diferentes de Violeta Brillante (BV) BD Horizon™" al final de este campo. Compensación y configuración: El tampón de tinción brillante BD Horizon™ Plus se puede utilizar en controles de compensación de un solo color con celdas. El tampón es compatible con las perlas BD® Compbeads; sin embargo, no se ha probado con perlas de compensación de otros fabricantes. Para obtener la compensación más precisa, los controles de compensación creados con celdas o perlas deben exponerse al tampón de tinción brillante BD Horizon™ durante el mismo tiempo que el panel multicolor correspondiente. Además, la compensación más precisa se obtendrá al utilizar el tampón de tinción brillante BD Horizon™ en todos los controles de compensación, incluidos los colorantes poliméricos y no poliméricos brillantes.
Avisos del producto: Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA, ubicados en Estados Unidos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Alexa Fluor® es una marca registrada de Life Technologies Corporation. El tampón de tinción brillante BD Horizon está cubierto por una o más de las siguientes patentes estadounidenses: 8,110,673; 8,158,444; 8,575,303; 8,354,239. Consulte http://regdocs.bd.com para acceder a las fichas de datos de seguridad (FDS).