BD, 567356, BD Pharmingen™ Alexa Fluor™ 647 Anexina V

Reactividad: Humana (Pruebas de control de calidad)
Isotipo: nulo nulo
Aplicación: Citometría de flujo (probada rutinariamente)
Vol. por prueba: 5 µl
ID del gen Entrez: 308
ID de registro: AB_3683800
Tampón de almacenamiento: Solución tamponada acuosa que contiene BSA y ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C y protegido de la luz. No congelar. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad. El anticuerpo se conjugó con el colorante en condiciones óptimas y se eliminó el colorante no reaccionado.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Alexa Fluor™ 647 Annexin V es una sonda sensible para identificar células apoptóticas, que se une a superficies de fosfolípidos con carga negativa con una mayor afinidad por la fosfatidilserina (PS) que la mayoría de los demás fosfolípidos. La unión de Alexa Fluor™ 647 Annexin V depende del calcio y se requieren concentraciones definidas de calcio y sal para una tinción óptima, como se describe en el Protocolo de tinción de Alexa Fluor™ 647 Annexin V. Los investigadores deben tener en cuenta que el análisis de citometría de flujo de Alexa Fluor™ 647 Annexin V en tipos de células adherentes (p. ej., HeLa, NIH-3T3, etc.) no se prueba de forma rutinaria, ya que puede producirse un daño específico de la membrana durante el desprendimiento o la recolección de células. Sin embargo, se han informado previamente métodos para utilizar Annexin V para citometría de flujo en tipos de células adherentes (Casiola-Rosen et al. y van Engeland et al.). INDUCCIÓN DE APOPTOSIS POR CAMPTOTECINA El siguiente protocolo se proporciona como una ilustración de cómo se puede usar Alexa Fluor™ 647 Annexin V en una línea celular (Jurkat). Materiales 1. Prepare la solución madre de camptotecina (Sigma-Aldrich Cat. No. C-9911): 1 mM en DMSO. 2. Células T Jurkat (ATCC TIB-152). Procedimiento 1. Añada camptotecina (concentración final 4-6 µM) a 1 × 10^6 células Jurkat. 2. Incube las células durante 4-6 horas a 37 °C. 3. Proceda con el protocolo de tinción de Alexa Fluor™ 647 Annexin V para medir la apoptosis. Reactivos 1. Alexa Fluor™ 647 Annexin V: Incluido. Use 5 µl por prueba. 2. 7-Amino-Actinomicina D (7-AAD): No incluido. El 7-AAD (n.º de cat. 559925) es un colorante de ácido nucleico práctico y listo para usar con fluorescencia detectable en el rango rojo lejano del espectro. Use 5 µl por prueba. 3. Tampón de unión de anexina 10X: No incluido. 0,1 M Hepes (pH 7,4), 1,4 M NaCl, 25 mM CaCl₂. Conservar a 4 °C. Alternativamente, puede adquirirse el tampón de unión de anexina V BD Pharmingen™, concentrado 10X (n.º de cat. 556454). PROTOCOLO DE TINCIÓN DE ANEXINA V Alexa Fluor™ 647 Tinción 1. Lave las células dos veces con PBS frío y, a continuación, resuspéndalas en tampón de unión 1× a una concentración de 1 × 10^6 células/ml. 2. Transferir 100 µl de la suspensión celular (1 × 10^5 células) a un tubo de cultivo de 5 ml. 3. Añadir 5 µl de Alexa Fluor™ 647 Annexin V (para análisis de uno y dos colores) y 5 µl de 7-AAD (solo para análisis de dos colores). 4. Agitar suavemente las células e incubar durante 15 min a TA (25 °C) en la oscuridad. 5. Añadir 400 µl de 1× Annexin V Binding Buffer a cada tubo. Analizar por citometría de flujo en 1 hora. CONTROLES SUGERIDOS PARA CONFIGURAR LA CITOMETRÍA DE FLUJO Los siguientes controles se utilizan para configurar la compensación y los cuadrantes: 1. Células sin teñir. 2. Células teñidas solo con Alexa Fluor™ 647 Annexin V (sin 7-AAD). 3. Células teñidas solo con 7-AAD (sin Alexa Fluor™ 647 Anexina V). Otros controles de tinción: Se debe utilizar una línea celular fácilmente inducida a la apoptosis para obtener una tinción de control positiva con Alexa Fluor™ 647 Anexina V sola o con Alexa Fluor™ 647 Anexina V y 7-AAD. Es importante destacar que el nivel basal de apoptosis y necrosis varía considerablemente dentro de una población. Por lo tanto, incluso en ausencia de apoptosis inducida, la mayoría de las poblaciones celulares contendrán un pequeño porcentaje de células con apoptosis positiva (positivas para Alexa Fluor™ 647 Anexina V, negativas para 7-AAD o positivas para Alexa Fluor™ 647 Anexina V, positivas para 7-AAD). La población no tratada se utiliza para definir el nivel basal de células apoptóticas y muertas. El porcentaje de células inducidas a apoptosis se determina restando el porcentaje de células apoptóticas de la población no tratada del porcentaje de células apoptóticas de la población tratada. Dado que la muerte celular es el resultado final de la apoptosis celular, las células en las últimas etapas de la apoptosis presentarán una membrana dañada y se tiñerán positivamente para 7-AAD, así como para Alexa Fluor™ 647 Annexin V. Por lo tanto, el ensayo no distingue entre células que ya han sufrido muerte celular apoptótica y aquellas que han muerto por la vía necrótica, ya que en ambos casos las células muertas se tiñerán tanto con Alexa Fluor™ 647 Annexin V como con 7-AAD.
Avisos del producto: Avisos del producto Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para conocer los protocolos técnicos. La emisión del fluorocromo Alexa Fluor® 647 se recoge con la misma configuración del instrumento que para la aloficocianina (APC). Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Este reactivo ha sido prediluido para su uso en el volumen por prueba recomendado. Normalmente utilizamos 1 × 10^6 células en una muestra experimental de 100 µl (una prueba). Para conocer los espectros de fluorocromo y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web de citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. La fuente de todas las proteínas séricas proviene de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en los Estados Unidos. Este producto se proporciona bajo una licencia de propiedad intelectual entre Life Technologies Corporation y BD Businesses. La compra de este producto le otorga al comprador el derecho intransferible de usar la cantidad comprada del producto y los componentes del producto en la investigación realizada por el comprador (ya sea que el comprador sea una entidad académica o con fines de lucro). El comprador no puede vender ni transferir de otra manera (a) este producto (b) sus componentes o (c) materiales hechos usando este producto o sus componentes a un tercero ni usar de otra manera este producto o sus componentes o materiales hechos usando este producto o sus componentes para Fines Comerciales. Fines Comerciales significa cualquier actividad realizada por una parte a cambio de una contraprestación y puede incluir, pero no está limitado a: (1) uso del producto o sus componentes en la fabricación; (2) uso del producto o sus componentes para proporcionar un servicio, información o datos; (3) uso del producto o sus componentes para fines terapéuticos, de diagnóstico o profilácticos; o (4) reventa del producto o sus componentes, ya sea que dicho producto o sus componentes se revendan o no para su uso en investigación. Para obtener información sobre la adquisición de una licencia de este producto para cualquier otro uso, comuníquese con Life Technologies Corporation, Unidad de Análisis Celular, Desarrollo de Negocios, 29851 Willow Creek Road, Eugene, OR 97402, EE. UU., Tel.: (541) 465-8300. Fax: (541) 335-0504. Consulte http://regdocs.bd.com para acceder a las fichas de datos de seguridad (FDS). Alexa Fluor™ es una marca registrada de Life Technologies Corporation. Para conocer las patentes estadounidenses aplicables, consulte bd.com/patents.