Bio-Rad, 17005710, Kit de preparación de biblioteca de ARN hebra completa SEQuoia, 96 reacciones

Un kit de secuenciación de ARN de alto rendimiento (RNA-Seq) que captura ARN largos y cortos en una única biblioteca, incluso a partir de muestras limitadas y de baja calidad. El kit proporciona todos los componentes necesarios para crear una biblioteca de ARN-Seq para las plataformas Illumina. El kit tiene capacidad para 96 ​​reacciones.
Descripción general
Preguntas frecuentes
Obtenga más información sobre cómo se utiliza este producto.
El kit de preparación de bibliotecas de ARN de cadena completa SEQuoia es un kit de ARN-Seq de alto rendimiento que captura ARN largos y cortos en una sola biblioteca, incluso a partir de muestras limitadas y de baja calidad. Su flujo de trabajo optimizado minimiza el número de pasos de pipeteo y reduce el tiempo total del protocolo a menos de 4 horas. El kit permite la construcción de bibliotecas con una cadena >99%, aptas para la secuenciación de nueva generación en plataformas Illumina, e incluye acceso a la solución y kit de herramientas de análisis SEQSense, un proceso dedicado al análisis de datos secundarios.
Con SEQzyme, una enzima patentada que acopla la síntesis de ADNc con la adición de adaptadores en una reacción de síntesis continua. Sus propiedades enzimáticas únicas capturan eficazmente todos los tipos y tamaños de especies de ARN en una novedosa reacción enzimática, mejorando significativamente la diversidad y la calidad de las bibliotecas de ARN, incluso a partir de muestras de ARN limitadas o degradadas.
Experimente el poder de SEQzyme
Características y beneficios
• Captura ARN largos y cortos en una sola preparación.
• Capaz de cumplir con bajos requisitos de entrada de muestra
• Validado con FFPE y otras muestras de baja calidad
• El protocolo completo se puede completar en menos de 4 horas.
Flujo de trabajo de preparación de biblioteca altamente eficiente y optimizado
Las propiedades enzimáticas únicas de SEQzyme producen una biblioteca de ARN robusta y de alta calidad. Los kits están optimizados para facilitar la síntesis eficiente de bibliotecas utilizando una amplia gama de ARN de entrada (de 100 pg a 1 μg) y son compatibles con la construcción automatizada de bibliotecas de secuenciación de última generación. El flujo de trabajo optimizado minimiza el número de pasos de pipeteo y reduce considerablemente el tiempo total del protocolo a menos de 4 horas.
Bibliotecas diversas con muestras de entrada limitadas y de baja calidad
El kit construye una biblioteca de cadena (>99%) que captura todos los biotipos de ARN, tanto ARN largos como cortos, incluso de ARN de baja calidad (por ejemplo, muestras de tejido FFPE). Esta función permite a los investigadores descubrir diferencias biológicamente relevantes en más áreas del transcriptoma.
Aplicaciones y usos
• Expresión genética diferencial y elaboración de perfiles de transcriptoma completo de muestras de ARN de alta y baja calidad. Microdisección de células individuales o clasificadas. Caracterización de ARN no poliadenilados. Identificación de fusión de genes. Descubrimiento de variación de un solo nucleótido.
• Células ordenadas o individuales
• Microdisección
• Caracterización de ARN no poliadenilados
• Identificación de fusión de genes
• Descubrimiento de variación de un solo nucleótido
• Descubrimiento de biomarcadores
• Identificación de uniones de empalme
Componentes incluidos
Cada kit incluye dos cajas de reactivos. La caja A incluye reactivos para la fragmentación de ARN, la síntesis de ADNc y la preparación de bibliotecas. El kit se conserva a –20 °C.
• Mezcla de fragmentación del reactivo A
• Enzima reparadora del extremo del reactivo B
• Reactivo C Tampón Poli(A)
• Reactivo D Poli(A) Polimerasa
• Reactivo E SEQzyme Mix
• Mezcla de amplificación del reactivo F
La caja B incluye una perla magnética para purificación. El kit se conserva a 4 °C.
Los cebadores de doble índice SEQuoia están disponibles y se pueden pedir por separado.
Preguntas frecuentes sobre el kit de preparación de bibliotecas de ARN completas SEQuoia
Contenido y almacenamiento del kit
¿Qué incluye un kit de preparación de biblioteca de ARN trenzado completo SEQuoia?
El kit de preparación de biblioteca de ARN completo SEQuoia proporciona todos los reactivos necesarios para construir una biblioteca a partir de ARN, con la excepción de las perlas SPRISelect de Beckman Coulter.
¿Hay materiales necesarios que no están incluidos en el kit?
Los siguientes reactivos son necesarios, pero no se suministran. Estos materiales se han validado con el protocolo del kit de preparación de bibliotecas de ARN de cadena completas SEQuoia. Las sustituciones podrían no producir resultados óptimos.
• Tiras de tubos y tapas para PCR de 2 ml, libres de ARNasa y ADNasa, de baja unión (TBC0802 o TBC1202)
• Puntas de pipeta filtradas sin ARNasa: 10 μl, 20 μl y 200 μl
• Cuentas SPRISelect de Beckman Coulter
• 10 mM Tris-HCl pH8 (libre de ARNasa y ADNasa)
• 80% de etanol (preparado fresco)
Materiales opcionales no proporcionados
• Conjunto de cebadores de doble índice SEQuoia (12011928) o placa de cebadores de doble índice SEQuoia (12011930)
• Kit de depleción de ARNr
• Kit de cuantificación de biblioteca ddPCR para Illumina TruSeq (1863040)
Lista de equipos
• Termociclador para temperaturas de incubación precisas
• Pipetas monocanal y multicanal calibradas: 10 μl, 20 μl y 200 μl
• Gradilla magnética para separación a pequeña escala de perlas magnéticas en tubos de 0,2 ml
• Vórtice
• Microcentrífuga para tubos de 0,2 ml
• Rack de enfriamiento para PCR de 96 pocillos
• Cubo de hielo
Preparación de la muestra
¿Qué método o kit de aislamiento de ARN debo utilizar?
La estrategia ideal de purificación de ARN depende del tipo de muestra y los objetivos experimentales. Hemos probado y recomendamos el uso del reactivo de aislamiento de ARN PureZOL (7326880) para muestras de tejido y el kit de lisis celular SingleShot (1725080) para células cultivadas. Si se desea obtener ARN pequeños, no recomendamos usar un kit basado en columna, ya que se pueden perder fragmentos de ARN menores de 200. En su lugar, utilice el kit de lisis celular SingleShot.
Además, estas referencias proporcionan una buena descripción general de varios métodos para el aislamiento de ARN pequeños;
• La cuantificación de ARN pequeños no codificantes permite una comparación precisa de los perfiles de expresión de miARN. Masotti A, et al. Journal of Biomedicine and Biotechnology, volumen 2009, ID del artículo 659028
• Comparación de kits de extracción automatizados y manuales disponibles comercialmente para el aislamiento de ARN total de pequeñas muestras de tejido. Sellin Jeffries MK, Kiss AJ, Smith AW, Oris JT. BMC Biotechnology, 201414:94
¿Qué rango de ARN total de entrada se puede utilizar en una preparación de biblioteca?
El kit de preparación de biblioteca de ARN hebra completa SEQuoia es compatible con 1 ng a 1 μg de ARN total (previamente agotado de ARN ribosómico)
Amplificación de bibliotecas de ARN
¿Cuántos ciclos de PCR se recomiendan para la amplificación de bibliotecas?
Normalmente, el kit de preparación de biblioteca de ARN monocatenario completo SEQuoia requiere de 3 a 5 ciclos menos que otros kits comerciales, debido a su alta tasa de conversión. Esto supone una ventaja, ya que la sobreamplificación puede generar artefactos como sesgo de amplificación, aumento de la tasa de duplicados y quimeras. Para minimizar los artefactos, optimice el número de ciclos de amplificación por PCR para que la concentración final de la biblioteca se encuentre entre 200 y 1000 ng. El número de ciclos de PCR depende de la cantidad y la calidad del ARN de entrada. La siguiente tabla proporciona directrices generales y puede utilizarse como punto de partida para la optimización.
Recomendaciones del ciclo de PCR
¿Qué moléculas captura el kit de preparación de biblioteca de ARN trenzado completo SEQuoia?
El kit de preparación de bibliotecas de ARN de cadena completas SEQuoia captura biotipos de ARN corto y largo, incluyendo ARNm, miARN, lncARN y snoARN. Dado que este kit captura eficientemente ARN pequeños, se recomienda una profundidad de secuenciación de 20 a 30 millones de lecturas para garantizar la precisión de los resultados.
Secuenciación y análisis de datos
¿Qué parámetros de secuenciación se recomiendan?
Recomendamos secuenciar con lecturas de un solo extremo para ahorrar en costos de secuenciación.
• Las primeras 8 bases en R2 son una secuencia de etiquetas aleatoria que se puede utilizar como UMI.
• Longitud de lectura recomendada: 100 x 8 o 75 x 8 de Lectura 1 x Lectura 2
La profundidad de lectura debe determinarse en función de la aplicación y la experiencia previa. El rango típico es de 20 a 30 millones de lecturas de un solo extremo debido a la cantidad de pequeños fragmentos de ARN capturados, lo que aumenta la complejidad de la biblioteca.
• Con lecturas únicas, utilizando el kit de preparación de biblioteca de ARN trenzado completo SEQuoia, puede obtener cobertura de la transcripción completa como se muestra con todos los datos en esta página.
• En el caso de lecturas de extremos de pares, puede haber una caída significativa en la calidad de lectura de R2 debido a la presencia de la secuencia poli(T).
¿El kit de preparación de biblioteca de ARN trenzado completo SEQuoia es compatible con la plataforma Ion Torrent?
No. Los adaptadores de los kits de preparación de bibliotecas de ARN trenzado completo SEQuoia son compatibles con las celdas de flujo utilizadas con las plataformas Illumina.
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Opciones de configuración
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