CST, 12267S, Kit de motivo de sustrato PTMScan® Phospho-ATM/ATR [pSQ]

PTMScan para estudiar en el área de investigación. Información de uso del producto Las células se lisan en un tampón con urea, las proteínas celulares se digieren con proteasas y los péptidos resultantes se purifican mediante extracción en fase sólida en fase reversa. A continuación, los péptidos se someten a purificación por inmunoafinidad utilizando un anticuerpo PTMScan® Motif conjugado con perlas de agarosa de proteína A. Los péptidos no unidos se eliminan mediante lavado y los péptidos capturados con PTM se eluyen con ácido diluido. La purificación en fase reversa se realiza en micropuntas para desalinizar y separar los péptidos del anticuerpo antes de concentrar los péptidos enriquecidos para su análisis por LC-MS/MS. CST recomienda el uso del tampón PTMScan® IAP n.° 9993, incluido en el kit. Almacenamiento Las perlas de anticuerpo se suministran en tampón IAP con 50 % de glicerol. Conservar a -20 °C. No alicuotar el anticuerpo. Protocolo Protocolos disponibles: PTMScan Fondo La tecnología PhosphoScan emplea un anticuerpo con motivo de residuo fosforado (Tyr, Ser, Thr) para la purificación por inmunoafinidad de fosfopéptidos a partir de extractos celulares, combinado con LC tándem MS/MS para identificar y cuantificar cambios en los niveles de fosforilación (1). La quinasa mutada de ataxia telangiectasia (ATM) y la quinasa relacionada con ataxia telangiectasia y Rad3 (ATR) son quinasas relacionadas que regulan los puntos de control del ciclo celular y la reparación del ADN (2). Los sustratos identificados para ATM son p53, p95/NBS1, MDM2, Chk2, BRCA1, CtIP, 4E-BP1 y Chk1 (2,3). La secuencia consenso para los sustratos de ATM/ATR es [pS/pTQ]. Los aminoácidos hidrofóbicos en las posiciones -3 y -1, y los aminoácidos con carga negativa en la posición +1 son determinantes positivos para el reconocimiento del sustrato por estas quinasas. Los residuos con carga positiva que rodean la [pS/pTQ] son ​​determinantes negativos para la fosforilación del sustrato (4). El complejo fenotipo de las células AT sugiere que probablemente tengan sustratos adicionales (4). Para comprender mejor la quinasa e identificar sustratos para la ATM y la quinasa relacionada, ATR, hemos desarrollado anticuerpos que reconocen la serina o treonina fosforilada en el motivo [pS/pTQ].