CST, 14809S, Kit de pan-metil lisina PTMScan®

PTMScan para estudiar en el área de investigación. Información de uso del producto Las células se lisan en un tampón con urea, las proteínas celulares se digieren con proteasas y los péptidos resultantes se purifican mediante extracción en fase sólida en fase reversa. A continuación, los péptidos se someten a purificación por inmunoafinidad utilizando un anticuerpo PTMScan® Motif conjugado con perlas de agarosa de proteína A. Los péptidos no unidos se eliminan mediante lavado y los péptidos capturados con PTM se eluyen con ácido diluido. La purificación en fase reversa se realiza en micropuntas para desalinizar y separar los péptidos del anticuerpo antes de concentrar los péptidos enriquecidos para su análisis por LC-MS/MS. CST recomienda el uso del tampón PTMScan® IAP n.° 9993, incluido en el kit. El kit PTMScan ® Pan-Methyl Lysine tiene una versión de perlas magnéticas de mayor sensibilidad y especificidad: el kit PTMScan ® HS Pan-Methyl Lysine en formatos de 10 ensayos (n.° 28411) o 3 ensayos (n.° 25012). Almacenamiento Las perlas de anticuerpo se suministran en tampón IAP con 50 % de glicerol. Conservar a -20 °C. No alicuotar el anticuerpo. Protocolo Protocolos disponibles: PTMScan Fondo La metilación de residuos de lisina es una modificación postraduccional reguladora (PTM) común que resulta en la mono-, di- o tri-metilación de la lisina en grupos ε-amina por las metiltransferasas de proteína lisina (PKMT). Se reconocen dos grupos de PKMT con base en la estructura y el mecanismo catalítico: las metiltransferasas de clase I o enzimas de siete cadenas β, y las metiltransferasas de clase V que contienen el dominio SET. Ambas utilizan el donador de metilo S-adenosil-L-metionina para metilar proteínas histonas y no histonas. Las metiltransferasas de clase I metilan aminoácidos, ADN y ARN (1,2). Se distinguen seis familias de proteínas que interactúan con metil-lisina con base en los dominios de unión: MBT, dedo PHD, Tudor, PWWP, repetición WD40 y cromodominios. Muchos de estos muestran preferencias de unión diferencial basadas en el estado de metilación de la lisina (3). Las lisina desmetilasas de la subfamilia KDM1 catalizan la desmetilación de mono- y di-metil lisinas, mientras que las enzimas de la subfamilia JmjC (KDM2-7) dependientes de 2-oxoglutarato también modifican residuos de tri-metil lisina (4). La mayoría de los sustratos de PKMT son proteínas histonas y factores de transcripción, lo que enfatiza la importancia de la metilación de la lisina en la regulación de la estructura de la cromatina y la expresión génica. Lys9 de la histona H3 es mono- o di-metilada por G9A/GLP y tri-metilada por SETDB1 para activar la transcripción. La desmetilación del mismo residuo mediada por JHDM3A crea mono-metil Lys9 e inhibe la transcripción génica (5). El supresor tumoral p53 está regulado por la metilación de al menos cuatro sitios. La transcripción mediada por p53 se reprime tras la monometilación de p53 en Lys370 por SMYD2; la dimetilación en el mismo residuo inhibe aún más a p53 al impedir su asociación con 53BP1. La dimetilación concomitante en Lys382 inhibe la ubiquitinación de p53 tras daño del ADN. La monometilación en Lys382 por SET8 suprime la actividad transcripcional de p53, mientras que la monometilación de SET7/9 en Lys372 inhibe la metilación de SMYD2 en Lys370 y estabiliza la proteína p53. La dimetilación en Lys373 por G9A/GLP inhibe la apoptosis mediada por p53 y se correlaciona con la trimetilación de la histona H3 Lys9 en el promotor p21 (1,6). La sobreexpresión de PKMT está asociada con múltiples formas de cáncer humano, lo que ha generado un enorme interés en apuntar a las metiltransferasas de proteína lisina en la investigación de descubrimiento de fármacos. Nombres alternativos Lisina; Metilo