CST, 26319S, anticuerpo monoclonal de conejo Phospho-Rpb1 CTD (Thr4) (D7L9W)

Anticuerpo monoclonal para el estudio del fosfato de POLR2A (Thr1618). Validado para Western Blot, IP de cromatina y CUT&RUN. Disponible en dos tamaños. Altamente específico y rigurosamente validado internamente, el anticuerpo monoclonal de conejo Phospho-Rpb1 CTD (Thr4) (D7L9W) (CST n.° 26319) está listo para su envío. Información de uso del producto Para obtener resultados óptimos de ChIP, utilice 10 µl de anticuerpo y 10 µg de cromatina (aproximadamente 4 x 10⁻¹ células) por IP. Este anticuerpo se ha validado con los kits de IP de cromatina enzimática SimpleChIP®. La dilución CUT&RUN se determinó con el kit de ensayo CUT&RUN n.° 86652. Western Blot: 1:1000 IP de cromatina: 1:50 CORTE Y CORRE: 1:50 Almacenamiento Se suministra en 10 mM de HEPES sódico (pH 7,5), 150 mM de NaCl, 100 µg/ml de BSA, 50 % de glicerol y menos del 0,02 % de azida sódica. Conservar a -20 °C. No alicuotar el anticuerpo. Protocolo Protocolos disponibles: Western Blotting, IP de cromatina, CUT&RUN Especificidad / Sensibilidad El anticuerpo monoclonal de conejo n.° 26319 para fosfo-Rpb1 CTD (Thr4) (D7L9W) reconoce los niveles endógenos de Rpb1 solo cuando la repetición heptapeptídica del dominio carboxiterminal (CTD) [Tyr1, Ser2, Pro3, Thr4, Ser5, Pro6, Ser7] está fosforilada en Thr4. Este anticuerpo no presenta reacción cruzada con Ser2, Ser5 o Ser7 fosforiladas en Rpb1 CTD. Reactividad de las especies: humano, ratón, rata, mono Fuente / Purificación El anticuerpo monoclonal se produce inmunizando animales con un fosfopéptido sintético correspondiente a los residuos que rodean a Thr4 de la repetición del heptapéptido CTD Rpb1 humano. Fondo La ARN polimerasa II (ARNPII) es un gran complejo multiproteico que funciona como una ARN polimerasa dependiente de ADN, catalizando la transcripción de ADN a ARN utilizando los cuatro ribonucleósidos trifosfato como sustratos (1). La subunidad más grande, la subunidad B1 de la ARNNPII (Rpb1), también conocida como subunidad A de la ARNNPII (POLR2A), contiene una secuencia heptapeptídica única (Tyr1, Ser2, Pro3, Thr4, Ser5, Pro6, Ser7), que se repite hasta 52 veces en el dominio carboxiterminal (CTD) de la proteína (1). Esta repetición heptapeptídica CTD está sujeta a múltiples modificaciones postraduccionales que determinan el estado funcional del complejo de la polimerasa. La fosforilación del CTD durante el ciclo de transcripción activo integra la transcripción con la remodelación de la cromatina y el procesamiento naciente del ARN mediante la regulación del reclutamiento de enzimas modificadoras de la cromatina y proteínas procesadoras del ARN al gen transcrito (1). Durante la iniciación de la transcripción, la ARNPII contiene un CTD hipofosforilado y se recluta a los promotores génicos mediante interacciones con factores de transcripción unidos al ADN y el complejo Mediador (1). El escape de la ARNPII de los promotores génicos requiere la fosforilación en Ser5 por CDK7, la subunidad catalítica del factor de transcripción IIH (TFIIH) (2). La fosforilación en Ser5 media el reclutamiento de enzimas de protección del ARN, además de las metiltransferasas de la histona H3 Lys4, que funcionan para regular la iniciación de la transcripción y la estructura de la cromatina (3,4). Después del escape del promotor, la ARNPII procede a través del gen hasta un sitio de pausa intrínseco, donde es detenida por los factores de elongación negativos NELF y DSIF (5). En este punto, la ARNPII es inestable y con frecuencia interrumpe la transcripción y se disocia del gen. La elongación transcripcional productiva requiere la fosforilación en Ser2 por CDK9, la subunidad catalítica del factor de elongación de la transcripción positiva P-TEFb (6). La fosforilación en Ser2 crea un complejo de elongación de la transcripción estable y facilita el reclutamiento de factores de empalme y poliadenilación del ARN, además de las metiltransferasas de la histona H3 Lys36, que promueven la cromatina compatible con la elongación (7,8). La ARNPII fosforilada en Ser2/Ser5 transcribe entonces la longitud completa del gen hasta el extremo 3', donde termina la transcripción. La ARNPII se disocia del ADN y se recicla a su forma hipofosforilada mediante diversas fosfatasas CTD (1). Además de la fosforilación de Ser2/Ser5, la Ser7 de la repetición heptapeptídica CTD también se fosforila durante el ciclo de transcripción activo. La fosforilación en Ser7 es necesaria para la transcripción eficiente de genes de ARN nuclear pequeño (sn) (9,10). Los genes de ARNns, que no están empalmados ni poliadenilados, son estructuralmente diferentes de los genes codificantes de proteínas. En lugar de la señal poli(A) presente en los ARN codificantes de proteínas, los ARNns contienen un elemento de procesamiento de ARN conservado en la caja 3', que es reconocido por el complejo de procesamiento del extremo 3' del ARNns Integrador (11,12). La fosforilación en Ser7 por CDK7 durante las primeras etapas de la transcripción facilita el reclutamiento de RPAP2, que desfosforila Ser5, creando una doble marca de fosforilación Ser2/Ser7 que facilita el reclutamiento del complejo Integrador y el procesamiento eficiente de las transcripciones de ARNsn nacientes (13-15). La fosforilación de la repetición heptapeptídica CTD de Rpb1 en Thr4 se conserva en gran medida desde la levadura hasta los mamíferos. Sin embargo, estudios de investigación realizados con proteínas Rpb1 mutantes en la fosforilación de Thr4 sugieren diferentes funciones para esta modificación entre especies. Si bien la fosforilación de Thr4 en la levadura no es esencial (16,17), los mutantes de Thr4 en sistemas de pollos y mamíferos resultan en errores de procesamiento del ARN y defectos globales en la elongación del ARN (18,19). La treonina 4 es fosforilada directamente por la polo-quinasa 3 (PLK3) y se cree que la actividad de la quinasa dependiente de ciclina-9 (CDK9) conduce directa o indirectamente a la fosforilación de este sitio (18,19). Nombres alternativos Subunidad mayor de la ARN polimerasa II dirigida por ADN, subunidad de 220 kDa de la ARN polimerasa II; subunidad A de la ARN polimerasa II dirigida por ADN; subunidad RPB1 de la ARN polimerasa II dirigida por ADN; subunidad mayor de la ARN polimerasa III dirigida por ADN; hRPB220; hsRPB1; MGC75453; NEDHIB; POL II; POLR2; POLR2A; POLRA; polipéptido A de la polimerasa (ARN) II (dirigido por ADN), 220 kDa; subunidad A de la polimerasa (ARN) II; subunidad A de la ARN polimerasa II; subunidad B1 de la ARN polimerasa II; subunidad RPB1 de la ARN polimerasa II dirigida por ARN; RNAPII; RPB1; RPBh1; RpIILS; RPO2; RPOL2 Especificación REACTIVIDAD: HMR Mk SENSIBILIDAD: Endógena Peso molecular (kDa): 250 Fuente/Isotipo: IgG de conejo