CST, 40366S, pAG-MNasa CUT&RUN y ADN de adición

Kit CUT&RUN para estudiar en el área de investigación. Información de uso del producto Para la enzima pAG-MNasa, tras la permeabilización celular y la unión del anticuerpo primario, resuspender las células en 50 µl de tampón de digitonina con 1,5 µl de enzima pAG-MNasa (dilución 33X). Incubar las muestras celulares con rotación a 4 °C durante 1 hora, lavar las células con tampón de digitonina y, a continuación, realizar la digestión de la cromatina. El ADN de normalización de muestras (SPIKE-IN) puede añadirse directamente al tampón de parada de la digestión. Para la normalización de muestras con NG-seq, añadir 5 µl (50 pg) de ADN de normalización de muestras (SPIKE-IN) a cada reacción. Al utilizar 100 000 células o 1 mg de tejido por reacción, se garantiza que las lecturas de normalización representen aproximadamente el 0,5 % del total de lecturas de secuenciación. Si se utilizan más o menos de 100.000 células o 1 mg de tejido por reacción, aumente o disminuya proporcionalmente el volumen de ADN añadido para la normalización de muestras para ajustar las lecturas de normalización a aproximadamente el 0,5 % del total de lecturas. Al realizar la normalización de muestras, asegúrese de asignar los datos de secuenciación CUT&RUN de todas las muestras tanto al genoma de referencia de la prueba (p. ej., humano) como al genoma de normalización de la muestra (S. cerevisiae). Almacenamiento La enzima pAG-MNasa se suministra en Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, PMSF 0,1 mM y glicerol al 50 %. No alicuotar el producto. El ADN de adición para normalización de muestras se suministra en Tris-HCl 10 mM (pH 8,0). Conservar ambos productos a -20 °C. Estos productos son estables durante al menos 12 meses. Protocolo Protocolos disponibles: CUT&RUN Fondo Al igual que el ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), la técnica de escisión bajo dianas y liberación mediante nucleasa (CUT&RUN) es potente y versátil, utilizada para sondear las interacciones proteína-ADN en el contexto natural de la cromatina celular (1-4). CUT&RUN proporciona un ensayo rápido, robusto y de bajo número de células para la detección de interacciones proteína-ADN en la célula. A diferencia del ensayo ChIP, CUT&RUN no presenta reticulación con formaldehído, fragmentación de la cromatina ni inmunoprecipitación, lo que lo convierte en un método mucho más rápido y eficiente para enriquecer las interacciones proteína-ADN e identificar genes diana. CUT&RUN se puede realizar en menos de un día, desde células vivas hasta ADN purificado, y se ha demostrado que funciona con tan solo 500-1000 células por ensayo (1,2). En lugar de fragmentar toda la cromatina celular, como se hace en ChIP, CUT&RUN utiliza una digestión de la cromatina dirigida por anticuerpos, lo que resulta en una señal de fondo mucho menor que la observada en el ensayo ChIP. Como resultado, CUT&RUN requiere solo una décima parte de la profundidad de secuenciación requerida para los ensayos ChIP-seq (1,2). Finalmente, la inclusión de ADN de control simple permite una cuantificación y normalización precisas de la unión de la proteína diana, algo que no es posible con el método ChIP. Esto proporciona una normalización eficaz de la señal entre muestras y entre experimentos. Nombres alternativos CnR; CORTAR Y CORRER; CORTAR Y ETIQUETAR; cortar y correr; cortar y etiquetar; CORTAR Y CORRER; CORTAR Y ETIQUETAR; cortar y correr; cortar y etiquetar; modificación de histonas