CST, 5131S, cebadores de intrón 1 CIS de ratón SimpleChIP®

Conjunto de cebadores para el estudio de CISH en el área de investigación. Información de uso del producto 1. Etiquete la cantidad adecuada de tubos o placas de PCR compatibles con el modelo de PCR en tiempo real que se utilizará. Las reacciones de PCR deben realizarse por duplicado e incluir un tubo sin ADN para controlar la contaminación y una dilución seriada de un 2 % de ADN de cromatina total de entrada (sin diluir, 1:5, 1:25, 1:125), que se utiliza para crear una curva estándar y determinar la eficiencia de la amplificación. 2. Añada 2 µl de la muestra de ADN ChIP adecuada a cada tubo o pocillo de la placa de PCR. 3. Prepare una mezcla maestra de reacción de PCR como se describe a continuación. Añada suficientes reactivos para dos reacciones adicionales para compensar la pérdida de volumen. Añadir 18 µl de la mezcla maestra de reacción de PCR a cada tubo o pocillo de reacción de PCR de la placa de PCR. Volumen de reactivo para 1 reacción de PCR (20 µl) H₂O libre de nucleasas: 6 µl Cebadores SimpleChIP® 5 µM: 2 µl Mezcla de reacción SYBR® Green 2X: 10 µl 4. Iniciar el siguiente programa de reacción de PCR: a. Desnaturalización inicial: 95 °C durante 3 min. b. Desnaturalización: 95 °C durante 15 s. c. Anneal y extensión: Temperatura específica del cebador durante 60 s. d. Repetir los pasos b y c para un total de 40 ciclos. 5. Analizar los resultados de la PCR cuantitativa utilizando el software incluido con el equipo de PCR en tiempo real. Almacenamiento Se suministra en agua sin nucleasas a una concentración de 5 μM (cada cebador tiene una concentración final de 5 μM). Conservar a -20 °C. Protocolo Protocolos disponibles: IP de cromatina Especificidad / Sensibilidad Reactividad de la especie: Ratón Fondo El ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es una técnica potente y versátil que se utiliza para investigar las interacciones proteína-ADN en el contexto cromatínico natural de la célula (1,2). Este ensayo puede utilizarse para identificar múltiples proteínas asociadas a una región específica del genoma o para identificar las numerosas regiones del genoma unidas por una proteína en particular (3-6). El ChIP puede utilizarse para determinar el orden específico de reclutamiento de diversas proteínas a un promotor génico o para medir la cantidad relativa de una modificación de histona específica en todo un locus génico (3,4). Además de las proteínas histonas, el ensayo ChIP puede utilizarse para analizar la unión de factores de transcripción y cofactores, factores de replicación del ADN y proteínas reparadoras del ADN. Al realizar el ensayo ChIP, las células se fijan primero con formaldehído, un agente de entrecruzamiento reversible proteína-ADN que preserva las interacciones proteína-ADN que ocurren en la célula (1,2). Las células se lisan y la cromatina se recolecta y fragmenta mediante sonicación o digestión enzimática. Posteriormente, la cromatina fragmentada se inmunoprecipita con anticuerpos específicos para una proteína o modificación de histona en particular. Cualquier secuencia de ADN asociada con la proteína o modificación de histona de interés coprecipitará como parte del complejo de cromatina reticulada, y la cantidad relativa de dicha secuencia de ADN se enriquecerá mediante el proceso de inmunoselección. Tras la inmunoprecipitación, se revierten los enlaces cruzados proteína-ADN y el ADN se purifica. La PCR estándar o la PCR cuantitativa en tiempo real se utilizan a menudo para medir el grado de enriquecimiento de una secuencia de ADN específica mediante una inmunoprecipitación específica para la proteína (1,2). Como alternativa, el ensayo ChIP puede combinarse con técnicas de microarray de teselación genómica (ChIP en chip), secuenciación de alto rendimiento (ChIP-Seq) o estrategias de clonación, todas las cuales permiten el análisis de todo el genoma de las interacciones proteína-ADN y las modificaciones de histonas (5-8). Los cebadores SimpleChIP se han optimizado para la amplificación de ADN aislado de ChIP mediante PCR cuantitativa en tiempo real y proporcionan controles positivos y negativos importantes que pueden usarse para confirmar un experimento de ChIP exitoso. Nombres alternativos ChIP; IP de cromatina; PCR; cebador; cebadores; SimpleChIP Especificación REACTIVIDAD: M