CST, 52749S, Kit PNGasa F

Kit Buffer para estudio en el área de investigación. Información de uso del producto Condiciones de la reacción desnaturalizante: 1. Añadir 1-20 µg de glicoproteína, 1 µL de tampón desnaturalizante de glicoproteína (10x) y H2O (si es necesario) para completar un volumen total de 10 µL. 2. Calentar la reacción a 100 °C durante 10 min para desnaturalizar la glicoproteína. 3. Enfriar la reacción en hielo y centrifugar durante 10 s. 4. Añadir 2 µL de tampón glicosilado II (10x), 2 µL de NP-40 al 10 % y 6 µL de H2O para completar un volumen total de reacción de 20 µL. Nota: La PNGasa F es inhibida por SDS, por lo que es esencial tener NP-40 en la mezcla de reacción en condiciones desnaturalizantes. Si no se incluye NP-40 en el protocolo de desnaturalización se perderá la actividad enzimática. 5. Añada 1 µL de PNGasa F y mezcle suavemente. 6. Incube a 37 °C durante 1 hora. 7. Analice con el método elegido. Nota: El método más sencillo para evaluar el grado de desglicosilación es mediante cambios de movilidad en geles SDS-PAGE. Nota: Los tiempos de incubación y las concentraciones enzimáticas óptimos deben determinarse empíricamente para cada sustrato individual. Condiciones de reacción no desnaturalizantes: Al desglicosilar una glicoproteína nativa, se recomienda someter una alícuota de la glicoproteína al protocolo de desnaturalización para proporcionar un control positivo de la proteína completamente desglicosilada. La reacción no desnaturalizada puede compararse entonces con la reacción desnaturalizada para determinar el grado de finalización de la reacción. 1. Añadir de 1 a 20 µg de glicoproteína, 2 µL de tampón desnaturalizante de glicoproteínas (10x) y H₂O (si es necesario) para completar un volumen total de 20 µL. 2. Añadir de 2 a 5 µL de PNGasa F y mezclar suavemente. 3. Incubar a 37 °C durante 4-24 h. Nota: Para desglicosilar una glicoproteína nativa, puede requerirse un tiempo de incubación más prolongado y una mayor cantidad de enzima. 4. Analizar con el método elegido. Nota: El método más sencillo para evaluar el grado de desglicosilación es mediante los cambios de movilidad en geles de SDS-PAGE. Almacenamiento Todos los componentes de este kit son estables durante 24 meses si se almacenan a la temperatura recomendada. Separe los componentes para evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación. Especificidad / Sensibilidad El kit PNGase F elimina eficazmente los niveles altos de manosa Fuente / Purificación El componente PNGase F se produce en una cepa de y está libre de proteasas y actividades Endo F.