CST, 9806S, tampón RIPA (10X)

Buffer para estudiar en el área de investigación. Información de uso del producto Este tampón puede presentar agregación al recibirse debido a las altas concentraciones de reactivos incluidos en la formulación 10X suministrada. En ocasiones, la agregación persiste a pesar de alcanzar la temperatura ambiente. Recomendamos calentar el tampón a 37 °C durante 15 minutos y mezclar para eliminar el precipitado. Como alternativa, diluir el tampón RIPA 10X con H₂D al menos 5 veces para obtener una solución sin precipitado. Una vez diluido, se puede alicuotar y almacenar a -20 °C para su uso posterior. 1. Descongele el tampón 10X a 24-30 °C, mezclando de principio a fin. 2. Diluya el tampón RIPA 10X hasta obtener una solución 1X con H₂D. Este producto proporciona suficiente material 10X para preparar 150 ml de extracto de células completas. 3. Enfríe el tampón 1X en hielo y añada 1 mM de PMSF justo antes de su uso. Lisis: Todos los reactivos y lisados ​​deben mantenerse fríos. 1. Trate las células como desee. 2. Lave la placa con PBS para eliminar el medio residual. 3. Añada 1X a las células: (a) Para células adherentes, añada 400 µl de tampón RIPA 1X/placa de 10 cm. (b) Para células no adherentes, agregue 400 µl de tampón por cada 107 células una vez que se hayan lavado en PBS 1X y se hayan sedimentado. 4. Incubar la placa en hielo durante 5 minutos. 5. Raspar las células. 6. Sonicar brevemente. 7. Centrifugar el extracto durante 5 minutos a 14 000 xg en una microcentrífuga fría. 8. Retirar el sobrenadante para su uso. El tampón RIPA 1X puede utilizarse para la lisis de muestras de tejido, aunque se recomienda homogeneizarlo después de añadirlo. Extraiga el tejido en una proporción de 100 mg por 1 ml de tampón. También es necesaria la sonicación del lisado tisular. Se pueden añadir inhibidores de proteasa adicionales al tampón de lisis 1X sin dificultad. Almacenamiento Tampón RIPA 1X: Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, Na₂EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, NP-40 al 1 %, desoxicolato de sodio al 1 %, pirofosfato de sodio 2,5 mM, beta-glicerofosfato 1 mM, Na₃VO₄ 1 mM, leupeptina 1 µg/ml. Para almacenamiento a largo plazo, mantenga el tampón 10X a -20 °C. Si el tampón se va a utilizar continuamente, se recomienda mantenerlo a 4 °C durante 1-2 semanas. Se recomienda alícuotas del tampón 10X si se van a realizar muchos experimentos pequeños. La solución 1X también puede alícuotarse en alícuotas de un solo uso y almacenarse a -20 °C.