New England Biolabs, B8533S, Diluyente B (con albúmina reconstituida)

Categorías relacionadas Buffers y diluyentes de endonucleasas de restricción Aplicaciones Digestión con enzimas de restricción Especificación Tampón 1X Componentes NaCl 300 mM Tris-HCl 10 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM Albúmina recombinante 500 µg/ml Glicerol al 50% pH 7,4 a 25 °C Preguntas frecuentes P: ¿Cuánto tiempo se puede almacenar la enzima diluida? R: No se ha probado la estabilidad de cada enzima diluida por debajo de la concentración de venta. Muchas enzimas permanecerán activas durante largos períodos de tiempo cuando se almacenan diluidas a -20 °C. Use un sustrato de control para probar las diluciones que se han almacenado. P: ¿Por qué mi enzima de restricción no corta el ADN? R: Puede haber varias razones diferentes por las que su enzima de restricción no corta el ADN como se revisa en este video. La preparación del ADN que se va a escindir debe estar libre de contaminantes como fenol, cloroformo, alcohol, EDTA, detergentes o exceso de sales, ya que todos estos pueden interferir con la actividad de las enzimas de restricción. Los kits de purificación de ácidos nucleicos Monarch pueden usarse para purificar el ADN de la muestra antes de la digestión. Si tiene dificultades para escindir el sustrato de ADN, recomendamos la siguiente reacción de control: incube el ADN experimental en un tampón de reacción sin enzima de restricción (la degradación del ADN indica contaminación en la preparación de ADN o en el tampón de reacción) y el ADN de control (ADN con múltiples sitios conocidos para la enzima, p. ej., ADN lambda) con enzima de restricción para determinar con mayor precisión si la reacción se completó o no. Si el ADN de control se escinde y el ADN experimental resiste la escisión, se pueden mezclar los dos ADN para determinar si hay un inhibidor presente en la muestra experimental. Si hay un inhibidor (a menudo sal, EDTA o fenol), el ADN de control no se cortará después de la mezcla. También hay disponible ayuda adicional para la resolución de problemas. La metilación del ADN también es un elemento importante de una digestión de restricción. Si se sospecha una inhibición de la metilación, consulte el enlace que describe la metilación de dam, dcm y CpG. P: ¿Por qué veo bandas de ADN adicionales en mi gel después de una digestión de restricción? R: Puede haber diferentes razones por las que se observan bandas adicionales en la digestión. Para obtener más información sobre este tema, consulte el video anterior. Normalmente, las bandas de ADN fuera del objetivo se deben a una digestión parcial o a la actividad estrella. Debe comparar su digestión con el patrón de bandas de ADN esperado. Si las bandas en ambos carriles son similares al patrón esperado y las bandas adicionales se limitan a espacios dentro de las bandas superior e inferior del patrón esperado, la digestión es incompleta (parcial). En este caso, puede que necesite purificar el ADN para eliminar cualquier contaminante, usar más enzima o aumentar el tiempo de incubación para asegurar una digestión completa. Si las bandas adicionales también se observan debajo de la banda inferior del patrón esperado, y se están cortando las bandas esperadas, es probable que la digestión presente actividad estrella. Las condiciones de su reacción están impulsando a la enzima a escindir secuencias de ADN adicionales no canónicas. Debe repetir la digestión bajo una o más de las siguientes condiciones de reacción modificadas: ∙ Disminuir la cantidad de enzima ∙ Disminuir el tiempo de incubación ∙ Aumentar el volumen de reacción o ∙ Usar una enzima de restricción NEB de alta fidelidad (HFTM) adecuada. P: ¿Cuántos nucleótidos debo agregar adyacentes al sitio de reconocimiento de RE para obtener un corte eficiente? R: Protocolo de digestión con enzimas de restricción: Corte cerca del extremo del ADN.