New England Biolabs, C2523I, NEBExpress® E. coli competente (alta eficiencia)

¿Tiene problemas para abrir sus tubos? Categorías relacionadas Expresión no T7,, Cepas de expresión de proteínas de E. coli,, E. coli, Cepas de expresión, Aplicaciones Expresión no T7,, Expresión de proteínas en, E. coli,,, Especificación de expresión de proteínas Antibiótico para la selección de plásmidos Antibióticos para la selección de plásmidos Concentración de trabajo Ampicilina 100 µg/ml Carbenicilina 100 µg/ml Cloranfenicol 33 µg/ml Kanamicina 30 µg/ml Tetraciclina 15 µg/ml Estreptomicina 25 µg/ml Notas de envío Envío en hielo seco Preguntas frecuentes P: ¿Ofrece New England Biolabs cepas de E. coli competentes adecuadas para la expresión de proteínas? R: Sí, tenemos varias cepas para la expresión de proteínas. BL21(DE3) (NEB #C2527) se ofrece para la expresión rutinaria de T7 y BL21 (NEB #C2530) para la expresión no T7. NEBExpress (NEB #C2523) es un derivado mejorado de BL21 y NEB Express Iq (NEB #C3037) ofrece una expresión estrictamente controlada a partir de vectores con promotores lac, tac, trc o T5-lac0. T7 Express Competent E. coli (NEB #C2566) y T7 Express Iq Competent E. coli (NEB #C3016) son derivados mejorados de BL21(DE3). La cepa lacIq permite un control más estricto de la expresión. Ambas están disponibles con la función lysY para un control excepcional de la expresión. (T7 Express lysY, NEB #C3010 y T7 Express lysY/Iq, NEB #C3013). NEB también ofrece cepas SHuffle™ capaces de plegar correctamente proteínas con múltiples enlaces disulfuro en el citoplasma. SHuffle™ Express (NEB #C3028H) puede utilizarse con promotores distintos de T7 o SHuffle™ Express T7 (NEB #C3029H) para vectores de expresión del promotor T7. Para la expresión del promotor T7 tóxico, SHuffle™ Express T7 lysY (NEB #C3030H) es ideal. Estas tres cepas también se ofrecen como cepas K12: SHuffle™ (NEB #C3025H), SHuffle™ T7 (NEB #C3026H) y SHuffle™ T7 lysY (NEB #C3027H). Lemo21(DE3) (NEB #C2528) está disponible para la expresión ajustable de dianas complejas, como proteínas de membrana, proteínas tóxicas y proteínas con tendencia a la expresión insoluble. NiCo21(DE3) (NEB n.° C2529) está diseñado para la expresión y purificación rutinarias de proteínas marcadas con His. P: ¿Cuánto tiempo debo incubar las células en hielo después de añadir el ADN (NEB n.° C2523H y NEB n.° C2523I)? R: Se recomienda incubar el ADN con células competentes de NEB Express en hielo durante 30 minutos. En las pruebas con pUC19, un tiempo de incubación de 20 minutos no afectó la eficiencia de la transformación (véase la figura en la página principal del producto). P: ¿Cuáles son las soluciones/recetas (C2523)? A: SOB: 2% peptona vegetal (o triptona) 0,5% extracto de levadura 10 mM NaCl 2,5 mM KCl 10 mM MgCl2 10 mM MgSO4 SOC: SOB + 20 mM glucosa Agar LB: 1% triptona 0,5% extracto de levadura 0,17 M NaCl 1,5% agar P: ¿Cuáles son las propiedades de la cepa (C2523)? R: Las propiedades de esta cepa que contribuyen a su utilidad como cepa de expresión de proteínas se describen a continuación. Los genotipos subyacentes a estas propiedades aparecen entre paréntesis. Deficiente en proteasa ([lon] ompT): Las cepas de E. coli B son ""naturalmente"" deficientes en la proteasa lon que en las cepas K-12 sirve para degradar las proteínas mal plegadas y para prevenir la acumulación de algunas proteínas específicas del ciclo celular. La proteasa OmpT reside en la superficie de la E. coli silvestre, tanto en las cepas K-12 como B, presumiblemente ayudando a las células a obtener aminoácidos de su entorno externo. Las células deficientes en ambas proteasas son mucho más susceptibles a la producción de proteínas a partir de genes clonados. Recuperación del daño del ADN (sulA11): Las células de E. coli pueden tolerar una cantidad sustancial de daño crónico del ADN siempre que se permita que proceda la reparación. Esta capacidad se ve comprometida si las células no pueden dividirse después de la reparación. En las células lon-, SulA, un inhibidor de la división celular, se acumula y hace que las células se vuelvan hipersensibles al daño del ADN. La mutación sulA permite que las células se dividan con mayor normalidad en ausencia de la proteasa Lon. Deficiencia de endonucleasa I: (endA) El espacio periplásmico de las células de E. coli silvestre contiene una endonucleasa no específica. Se debe tener mucho cuidado para evitar la degradación de los plásmidos preparados a partir de estas células. La mutación endA elimina esta endonucleasa y puede mejorar significativamente la calidad de las preparaciones de plásmidos. Restricción deficiente: (Δ(mcrC-mrr)114::IS10) Las cepas silvestres de E. coli B portan una endonucleasa de restricción de tipo I que escinde el ADN con el sitio TGA(N8)TGCT. Si bien el ADN de E. coli está protegido de la degradación por una metiltransferasa cognada, el ADN extraño se cortará en estos sitios. La deleción descrita anteriormente elimina tanto la metilasa como la endonucleasa. Restricción deficiente de metilo: (Δ(mcrC-mrr)114::IS10 y R(mcr-73::miniTn10--TetS)2): E. coli tiene un sistema de enzimas codificadas por mcrA, mcrBC y mrr que escindirán el ADN con patrones de metilación encontrados en eucariotas superiores, así como algunas cepas vegetales y bacterianas. Las tres enzimas Mcr y Mrr han sido inactivadas en T7 Express, lo que permite la introducción de ADN eucariota de origen genómico (p. ej., bibliotecas primarias) si se desea. Resistente al fago T1: (fhuA2) T1, un fago extremadamente virulento, requiere el receptor de captación de hidroxamato férrico de E. coli para su infectividad. La eliminación de este gen confiere resistencia a este tipo de fago, pero no afecta significativamente las características de transformación o crecimiento de la célula. P: ¿Cuál es la diferencia entre NEB #C2523H y NEB #C2523I? R: Son las mismas células con la misma eficiencia, pero se proporcionan en diferentes formatos. C2523H se envasa con 20 tubos de transformación de un solo uso, cada uno con 50 μl de células competentes. El plásmido o el producto de ligadura se pueden agregar directamente a los tubos de transformación para mayor comodidad. C2523I se envasa con 6 tubos, cada uno con 200 μl de células competentes. Los tubos deben descongelarse en hielo y transferirse 50 μl de células a tubos nuevos antes de la transformación. Cada tubo contiene suficientes células para 4 transformaciones, lo que reduce el coste de cada una. Si se realizan 3 o 4 transformaciones a la vez, el uso de C2523I resulta rentable. No se recomienda volver a congelar las células competentes después de la descongelación, ya que esto reducirá significativamente la eficiencia de la transformación. P: ¿Por qué no hay colonias ni crecimiento en el cultivo líquido (C2523)? R: Puede haber expresión basal en el huésped NEBExpress. Si es probable que la proteína expresada sea tóxica, la transformación del plásmido de expresión debe realizarse en: » NEB Express Iq (NEB# C3037): la sobreexpresión del represor LacI reduce la expresión basal. La incubación a 30 °C o a temperatura ambiente también puede aliviar los problemas de toxicidad. Además, verifique la concentración de antibiótico (pruebe con el plásmido de control). P: ¿Por qué la proteína inducida es insoluble (C2523)? A: Verifique la insolubilidad: esto es importante porque la alta expresión y alta producción de proteína pueden dar como resultado que la proteína objetivo se vuelva insoluble. Las posibles soluciones para esto son: » Inducir a temperaturas más bajas (tan bajas como 15 °C durante la noche) » Reducir la concentración de IPTG a entre 0,01 mM y 0,1 mM » Inducir durante menos tiempo (tan solo 15 minutos) » Inducir más temprano en el crecimiento (OD600 = 0,3 o 0,4) P: ¿Por qué no hay proteína visible en el gel o no hay actividad (C2523)? R: Verifique la toxicidad: la ausencia de proteína puede significar que las células han eliminado o eliminado elementos en el plásmido de expresión. » Cultivar células para la inducción de proteínas. Justo antes de la inducción, sembrar una muestra en placas duplicadas con y sin selección de antibióticos. Si la toxicidad es un problema, habrá una diferencia significativa entre el número de colonias en las placas. Se verán menos colonias en las placas que contienen antibiótico (lo que indica que se ha perdido el plásmido) en comparación con las placas sin antibiótico. » Si el problema es la toxicidad, pruebe el huésped Iq anterior para reducir la expresión a nivel basal. P: ¿Puedo almacenar células competentes a -20 °C en lugar de -80 °C? R: Las células competentes deben almacenarse a -80 °C. El almacenamiento a -20 °C resultará en una disminución significativa en la eficiencia de transformación (TE). Cuando se probó en NEB 5-alpha Competent E. coli (NEB #C2987H), las células perdieron el 94,5 % de TE después de solo 24 horas de almacenamiento a -20 °C. Las células perdieron el 98,9 % de TE después de 2 días y el 99,6 % de TE después de una semana de almacenamiento a -20 °C. P: ¿Se puede utilizar NEBExpress Competent E. coli (High Efficiency) para la expresión de construcciones que contienen un promotor T7? R: No. NEBExpress Competent E. coli no admite la expresión de construcciones que contienen un promotor T7. Para la expresión de estos constructos, recomendamos T7 Express Competent E. coli (High Efficiency) (NEB #C2566). P: ¿Cuál es el tiempo óptimo de choque térmico para esta cepa (NEB #C2523H y NEB #C2523I)? R: El choque térmico a 42 °C durante 20 segundos da como resultado la mayor eficiencia de transformación para NEBExpress competen E. coli (NEB #C2523H y NEB #C2523I). Espere aproximadamente una pérdida del 50 % en la eficiencia de transformación cuando el choque térmico dura 80 segundos (consulte la figura en la página principal del producto). P: ¿Qué tipo de tubos de transformación se deben utilizar? R: En comparación con el tubo de 2,0 ml proporcionado con las células competentes de formato de un solo uso NEB, el tubo Eppendorf de 1,5 ml que probamos funcionó bien. P: ¿Qué volumen de ADN se puede agregar a las células competentes? R: El volumen de ADN que se agrega a las células competentes afecta la eficiencia de transformación. Se recomiendan de 1 a 5 µl de ADN (plásmido o producto de ligación) para 50 µl de células competentes. En 50 µl de células competentes, la eficiencia de transformación disminuye al 52 % cuando el volumen de ADN aumenta a 10 µl (de 2 µl). La eficiencia de transformación disminuye al 18 % cuando el volumen de ADN aumenta a 20 µl (de 2 µl). La eficiencia de transformación disminuye al 5,2 % cuando el volumen de ADN aumenta a 50 µl (de 2 µl). P: ¿Cuál es la vida útil de esta cepa (NEB #C2523H y NEB #C2323I)? R: La fecha de caducidad es de dos años a partir de la fecha de ensayo proporcionada con el producto. P: ¿Son las células competentes de NEB compatibles con el protocolo "Mix & Go"? R: Existe un protocolo "Mix and Go" que proporciona una forma rápida de transformar sus células simplemente agregando plásmido a las células y sembrando. No se requiere un paso de choque térmico. NEB ha probado nuestras células competentes en este protocolo contra el producto "Mix & Go" de otra compañía. Hemos observado que ambos producen un número similar de colonias; sin embargo, las colonias de NEB son más grandes con el mismo período de incubación. P: ¿Cómo debo almacenar el medio de crecimiento SOC? El SOC que recibí con mis células competentes recomienda almacenarlo a temperatura ambiente o a 4 °C; sin embargo, al comprarlo como producto independiente, recomienda almacenarlo a 4 °C. ¿Cuál es mejor? R: El medio SOC se puede almacenar a 4 °C o a temperatura ambiente, dependiendo de la rapidez con la que se vaya a usar. Almacenar a temperatura ambiente es conveniente y adecuado para usos a corto plazo (de semanas a un par de meses). Para almacenamiento a largo plazo, recomendamos almacenarlo a 4 °C. Tenga en cuenta que el medio de crecimiento 1.5 suministrado con NEB #C2987R (formato de placa de 1 x 384 pocillos) solo debe almacenarse a temperatura ambiente o se formarán cristales.