New England Biolabs, C2527H, BL21(DE3) E. coli competente

¿Tiene problemas para abrir sus tubos? Categorías relacionadas: Expresión de T7, Cepas de expresión de proteínas de E. coli, E. coli, Cepas de expresión, Aplicaciones: Expresión de T7, Ligadura de péptidos, Expresión de proteínas en E. coli, Especificaciones: Antibiótico para la selección de plásmidos. Antibióticos para la selección de plásmidos. Concentración de trabajo: Ampicilina 100 µg/ml. Carbenicilina 100 µg/ml. Cloranfenicol 33 µg/ml. Kanamicina 30 µg/ml. Estreptomicina 25 µg/ml. Tetraciclina 15 µg/ml. Notas de envío: Envío en hielo seco. Preguntas frecuentes : P: ¿Ofrece New England Biolabs cepas de E. coli competentes aptas para la expresión de proteínas? R: Sí, disponemos de varias cepas para la expresión de proteínas. BL21(DE3) (NEB #C2527) se ofrece para la expresión rutinaria de T7 y BL21 (NEB #C2530) para la expresión no T7. NEBExpress (NEB #C2523) es un derivado mejorado de BL21 y NEB Express Iq (NEB #C3037) ofrece una expresión estrictamente controlada a partir de vectores con promotores lac, tac, trc o T5-lac0. T7 Express Competent E. coli (NEB #C2566) y T7 Express Iq Competent E. coli (NEB #C3016) son derivados mejorados de BL21(DE3). La cepa lacIq permite un control más estricto de la expresión. Ambas están disponibles con la función lysY para un control excepcional de la expresión. (T7 Express lysY, NEB #C3010 y T7 Express lysY/Iq, NEB #C3013). NEB también ofrece cepas SHuffle™ capaces de plegar correctamente proteínas con múltiples enlaces disulfuro en el citoplasma. SHuffle™ Express (NEB #C3028H) puede utilizarse con promotores distintos de T7 o SHuffle™ Express T7 (NEB #C3029H) para vectores de expresión del promotor T7. Para la expresión del promotor T7 tóxico, SHuffle™ Express T7 lysY (NEB #C3030H) es ideal. Estas tres cepas también se ofrecen como cepas K12: SHuffle™ (NEB #C3025H), SHuffle™ T7 (NEB #C3026H) y SHuffle™ T7 lysY (NEB #C3027H). Lemo21(DE3) (NEB #C2528) está disponible para la expresión ajustable de dianas complejas, como proteínas de membrana, proteínas tóxicas y proteínas con tendencia a la expresión insoluble. NiCo21(DE3) (NEB #C2529) está diseñado para la expresión y purificación rutinarias de proteínas marcadas con His. P: ¿Cuáles son las propiedades de la cepa (C2527)? R: Las propiedades de esta cepa que contribuyen a su utilidad como cepa de expresión de proteínas se describen a continuación. Los genotipos subyacentes a estas propiedades aparecen entre paréntesis. ARN polimerasa T7: (gen T7 1) está codificada por el profago lambda DE3 presente en el cromosoma. La ARN polimerasa T7 se expresa a partir del promotor lacUV5, que es menos sensible a la represión catabólica que el promotor wt lac. Por lo tanto, las cepas DE3 pueden exhibir una expresión de proteína diana no inducida. Aunque λDE3 normalmente está latente en el cromosoma del huésped, la inducción de la cascada SOS puede ocurrir como resultado de la expresión de proteínas que dañan el cromosoma de E. coli, ya sea directa o indirectamente. Esto puede conducir a la lisis celular. Las cepas T7 Express no portan el profago DE3 y toleran mejor una respuesta SOS. Deficiente en proteasa ([lon] ompT): Las cepas de E. coli B son deficientes de forma natural en la proteasa lon, que en las cepas K-12 sirve para degradar las proteínas mal plegadas y evitar la acumulación de algunas proteínas específicas del ciclo celular. La proteasa OmpT reside en la superficie de la E. coli silvestre, tanto en las cepas K-12 como B, presumiblemente ayudando a las células a obtener aminoácidos de su entorno externo. Las células deficientes en ambas proteasas son mucho más susceptibles a la producción de proteínas a partir de genes clonados. Resistente al fago T1 (fhuA2): T1, un fago extremadamente virulento, requiere el receptor de captación de hidroxamato férrico de E. coli para su infectividad. La eliminación de este gen confiere resistencia a este tipo de fago, pero no afecta significativamente las características de transformación o crecimiento de la célula. P: ¿Por qué no hay colonias o no hay crecimiento en el cultivo líquido (C2527)? A: La expresión de T7 en BL21(DE3) no está estrictamente regulada, por lo que las proteínas tóxicas pueden afectar la viabilidad celular, especialmente si el vector de expresión no codifica lacI. Para una expresión estrictamente regulada, utilice una cepa que exprese lysY: T7 Express lysY (NEB #C3010): lysY produce lisozima T7 mutante que se une a la ARN polimerasa T7, reduciendo la expresión basal de la proteína diana. Tras la inducción, la ARN polimerasa T7 recién producida titula la lisozima y da como resultado la expresión de la proteína diana. T7 Express lysY/Iq (NEB #C3013): expresión de lysY y sobreexpresión de lacI para reprimir la expresión basal de la ARN polimerasa T7. Lemo21(DE3) (NEB #C2528): BL21(DE3) con el Sistema Lemo™. La expresión de lysY está modulada por L-ramnosa, lo que hace que la expresión de la proteína T7 esté estrechamente regulada y sea ajustable. P: ¿Por qué la proteína inducida es insoluble (C2527)? R: Verifique la insolubilidad: esto es importante porque la expresión de T7 a menudo conduce a una producción muy alta de proteína que puede hacer que la proteína objetivo se vuelva insoluble. Las soluciones en torno a esto son: Inducir a una temperatura más baja (tan baja como 15 °C durante la noche) Reducir la concentración de IPTG a 40 µM Inducir más temprano en la fase de crecimiento (OD600 = 0,3 o 0,4) Probar la expresión en Lemo21 (DE3) P: ¿Por qué no hay proteína visible en el gel o no hay actividad (C2527)? R: Verifique la toxicidad: la ausencia de proteína puede significar que las células han eliminado o eliminado elementos en el plásmido de expresión. Cultivar células para la inducción de proteínas. Justo antes de la inducción, sembrar una muestra en placas duplicadas con y sin selección de antibióticos. Si la toxicidad es un problema, habrá una diferencia significativa entre el número de colonias en las placas. Se observarán menos colonias en las placas que contienen antibiótico (lo que indica que se ha perdido el plásmido) en comparación con las placas sin antibiótico. Verifique la integridad del clon mediante análisis de enzimas de restricción o secuenciación del ORF. Si la toxicidad es el problema, las cepas que expresan lysY proporcionarán estabilidad al clon. P: ¿Cuáles son las soluciones/recetas (C2527)? R: Soluciones/Recetas SOB: 2% peptona vegetal (o triptona) 0,5% extracto de levadura 10 mM NaCl 2,5 mM KCl 10 mM MgCl2 10 mM MgSO4 SOC: SOB + 20 mM glucosa Agar LB: 1% triptona 0,5% extracto de levadura 0,17 M NaCl 1,5% agar P: ¿Puedo almacenar células competentes a -20 °C en lugar de -80 °C? R: Las células competentes deben almacenarse a -80 °C. El almacenamiento a -20 °C resultará en una disminución significativa en la eficiencia de transformación (ET). Cuando se probó en NEB 5-alpha Competent E. coli (NEB #C2987H), las células perdieron el 94,5% de la ET después de solo 24 horas de almacenamiento a -20 °C. Las células perdieron el 98,9% de la ET después de 2 días y el 99,6% de la ET después de una semana de almacenamiento a -20 °C. P: ¿Qué tipo de tubos de transformación se deben usar? R: En comparación con el tubo de 2,0 ml proporcionado con las células competentes de formato de un solo uso de NEB, el tubo Eppendorf de 1,5 ml que probamos funcionó bien. P: ¿Qué volumen de ADN se puede agregar a las células competentes? R: El volumen de ADN que se agrega a las células competentes afecta la eficiencia de transformación. Se recomienda de 1 a 5 µl de ADN (plásmido o producto de ligación) para 50 µl de células competentes. En 50 µl de células competentes, la eficiencia de transformación disminuye al 52 % cuando el volumen de ADN aumenta a 10 µl (de 2 µl). La eficiencia de transformación disminuye al 18 % cuando el volumen de ADN aumenta a 20 µl (de 2 µl). La eficiencia de transformación disminuye al 5,2 % cuando el volumen de ADN aumenta a 50 µl (de 2 µl). P: ¿Cuál es la vida útil de esta cepa (NEB #C2527H y NEB #C2527I)? R: La fecha de caducidad es de un año a partir de la fecha de ensayo proporcionada con el producto. P: ¿Son las células competentes de NEB compatibles con el protocolo "Mix & Go"? R: Existe un protocolo "Mix & Go" que proporciona una forma rápida de transformar sus células simplemente agregando plásmido a las células y sembrando. No se requiere un paso de choque térmico. NEB ha probado nuestras células competentes en este protocolo contra el producto "Mix & Go" de otra compañía. Hemos observado que ambas producen un número similar de colonias; sin embargo, las colonias NEB son de mayor tamaño con el mismo período de incubación. P: ¿Cuál es la diferencia entre las células de E. coli competentes BL21 y BL21(DE3)? R: Ambas cepas son cepas B y, por lo tanto, ambas presentan deficiencias en la proteasa Lon (citoplasma) y la proteasa OmpT (membrana externa). Por consiguiente, las cepas B son generalmente preferidas para la expresión de proteínas recombinantes. La designación DE3 significa que las respectivas cepas contienen el lisógeno λDE3, que porta el gen de la ARN polimerasa T7 bajo el control del promotor lacUV5. Se requiere IPTG para inducir al máximo la expresión de la ARN polimerasa T7 y así expresar los genes recombinantes clonados aguas abajo de un promotor T7. BL21(DE3) es adecuado para la expresión a partir de un promotor T7 o T7-lac o promotores reconocidos por la ARN polimerasa de E. coli: p. ej., lac, tac, trc, ParaBAD, PrhaBAD y también el promotor T5. Tenga en cuenta que BL21 no lleva el gen para la ARN polimerasa T7 y, por lo tanto, solo es adecuado para la expresión a partir de promotores reconocidos por la ARN polimerasa de E. coli: p. ej., lac, tac, trc, ParaBAD, PrhaBAD y también el promotor T5. P: ¿Cómo debo almacenar el medio de crecimiento SOC? El SOC que recibí con mis células competentes recomienda almacenarlo a temperatura ambiente o a 4 °C; sin embargo, cuando lo compro como producto independiente, recomienda almacenarlo a 4 °C. ¿Cuál es mejor? R: El medio SOC se puede almacenar a 4 °C o a temperatura ambiente, dependiendo de la rapidez con la que se vaya a utilizar. El almacenamiento a temperatura ambiente es conveniente y adecuado para usos a corto plazo (de semanas a un par de meses). Para almacenamiento a largo plazo, recomendamos almacenar a 4 °C. Tenga en cuenta que el medio de crecimiento 1.5 suministrado con NEB n.° C2987R (formato de placa de 1 x 384 pocillos) solo debe almacenarse a temperatura ambiente o se formarán cristales. P: ¿Está la expresión de T7 sujeta a represión catabólica en BL21(DE3) y cepas derivadas? R: El profago lambda DE3 porta el gen de la ARN polimerasa de T7 (T7gene1). La expresión de la ARN polimerasa de T7 está controlada por el promotor lacUV5. Por lo tanto, la adición de glucosa resultará en represión catabólica y la expresión proteica basal de los vectores promotores de T7 se controlará mejor cuando la glucosa esté presente en el medio. Cuando el glicerol es la principal fuente de carbono, no debería haber ningún efecto en la expresión basal de T7.