New England Biolabs, C2528J, Lemo21(DE3) E. coli competente

Químicamente competente Categorías relacionadas Expresión de T7,, Cepas de expresión de proteínas de E. coli,, E. coli, Cepas de expresión, Aplicaciones Expresión de T7,, Expresión de proteínas tóxicas,, Expresión de proteínas de membrana, Especificación Antibiótico para selección de plásmidos Antibióticos para selección de plásmidos Concentración de trabajo Ampicilina 100 µg/ml Carbenicilina 100 µg/ml Kanamicina 30 µg/ml Estreptomicina 25 µg/ml Tetraciclina 15 µg/ml Notas de envío Se envía en hielo seco Preguntas frecuentes P: ¿Cuáles son las soluciones/recetas (C2528)? A: SOB: 2% peptona vegetal (o triptona) 0,5% extracto de levadura 10 mM NaCl 2,5 mM KCl 10 mM MgCl2 10 mM MgSO40,17 M NaCl Agar LB: 1% triptona 0,5% extracto de levadura 1,5% agar P: ¿Cuáles son las propiedades de la cepa (C2528)? R: Las propiedades de esta cepa que contribuyen a su utilidad como cepa de expresión de proteínas se describen a continuación. Los genotipos subyacentes a estas propiedades aparecen entre paréntesis. ARN polimerasa T7: (gen T71) está codificada por el profago lambda DE3 presente en el cromosoma. La ARN polimerasa T7 se expresa a partir del promotor lacUV5, que es menos sensible a la represión por catabolitos que el promotor wt lac. Por lo tanto, las cepas DE3 pueden exhibir una expresión de proteína diana no inducida. Esto se remedia mediante la expresión de la lisozima T7 (LysY). lysY: gen que codifica la variante K128Y de la lisozima del fago T7. LysY carece de actividad amidasa pero conserva la capacidad de inhibir la ARN polimerasa T7. Deficiente en proteasa ([lon] ompT): las cepas de E. coli B son "naturalmente" deficientes en la proteasa lon que en las cepas K-12 sirve para degradar proteínas mal plegadas y para prevenir la acumulación de algunas proteínas específicas del ciclo celular. La proteasa OmpT reside en la superficie de la E. coli de tipo silvestre en las cepas K-12 y B, presumiblemente ayudando a las células a derivar aminoácidos de su entorno externo. Las células deficientes en ambas proteasas son mucho más susceptibles a la producción de proteínas a partir de genes clonados. Resistente al fago T1 (fhuA2): T1, un fago extremadamente virulento requiere el receptor de captación de hidroxamato férrico de E. coli para la infectividad. La eliminación de este gen confiere resistencia a este tipo de fago, pero no afecta significativamente las características de transformación o crecimiento de la célula. P: ¿Por qué no hay colonias o no hay crecimiento en cultivo líquido (C2529)? R: Este resultado a menudo se debe a la expresión basal de un producto génico diana, lo cual es perjudicial para la viabilidad celular. La expresión basal de la proteína diana en NiCo21(DE3) es idéntica a la expresión basal en BL21(DE3). Algunos sistemas de vectores (en particular los que utilizan un promotor T7) permiten la expresión sin inductor. Si se requiere una expresión de T7 estrechamente regulada, utilice una cepa que exprese lysY: T7 Express lysY (NEB #C3010) lysY produce una lisozima T7 mutante que se une a la ARN polimerasa T7, lo que reduce la expresión basal de la proteína diana. Tras la inducción, la ARN polimerasa T7 recién producida titula la lisozima y da como resultado la expresión de la proteína diana. T7 Express lysY/Iq (NEB #C3013) expresión de lysY, así como sobreexpresión de lacI para reprimir la expresión basal de la ARN polimerasa T7. Lemo21(DE3) (NEB #C2528) BL21(DE3) que contiene el Sistema Lemo™. La expresión de LysY está modulada por L-ramnosa, lo que hace que la expresión de la proteína T7 esté estrictamente regulada y ajustable. P: ¿Por qué la proteína inducida es insoluble (C2528)? R: Verifique la insolubilidad: esto es importante porque la expresión incontrolada de T7 a menudo conduce a una producción muy alta de proteína que puede resultar en la insoluble de la proteína objetivo. Las soluciones para esto son: Inducir a una temperatura más baja (20 a 30 °C); Inducir más temprano en la fase de crecimiento (OD600 = 0,3 o 0,4); Probar la expresión utilizando un rango completo de concentraciones de L-ramnosa: 0 a 2000 µM (ver figura en la página principal del producto). P: ¿Por qué no se observa proteína en el gel o no hay actividad (C2528)? R: Compruebe la toxicidad: la ausencia de proteína puede indicar que las células han eliminado elementos del plásmido de expresión. Cultive las células para la inducción de proteínas. Justo antes de la inducción, sembrar una muestra en placas duplicadas con y sin selección con antibiótico. Si la toxicidad es un problema, habrá una diferencia significativa entre el número de colonias en las placas. Se observarán menos colonias en las placas con antibiótico (lo que indica que el plásmido se ha perdido) en comparación con las placas sin antibiótico. Compruebe la integridad del clon mediante análisis de enzimas de restricción o secuenciación del ORF. Si la toxicidad es el problema, añada 500 µM de L-ramnosa a las placas de selección y al medio de cultivo iniciador. P: ¿Puedo almacenar células competentes a -20 °C en lugar de a -80 °C? R: Las células competentes deben almacenarse a -80 °C. El almacenamiento a -20 °C provocará una disminución significativa de la eficiencia de transformación (ET). Cuando se probó en NEB 5-alpha Competent E. coli (NEB #C2987H), las células perdieron el 94,5% de TE después de solo 24 horas de almacenamiento a -20 °C. Las células perdieron el 98,9% de TE después de 2 días y el 99,6% de TE después de una semana de almacenamiento a -20 °C. P: ¿Qué tipo de tubos de transformación se deben usar? R: En comparación con el tubo de 2,0 ml proporcionado con células competentes de formato de un solo uso NEB, el tubo Eppendorf de 1,5 ml que probamos funcionó bien. P: ¿Qué volumen de ADN se puede agregar a las células competentes? R: El volumen de ADN que se agrega a las células competentes afecta la eficiencia de la transformación. Se recomiendan de 1 a 5 µl de ADN (plásmido o producto de ligación) para 50 µl de células competentes. En 50 µl de células competentes, la eficiencia de la transformación cae al 52% cuando el volumen de ADN se aumenta a 10 µl (de 2 µl). La eficiencia de transformación disminuye al 18 % cuando el volumen de ADN aumenta de 2 µl a 20 µl. La eficiencia de transformación disminuye al 5,2 % cuando el volumen de ADN aumenta de 2 µl a 50 µl. P: ¿Cuál es la vida útil de esta cepa (NEB n.° C2528H)? R: La fecha de caducidad es de un año a partir de la fecha de ensayo proporcionada con el producto. P: ¿Son las células competentes de NEB compatibles con el protocolo "Mix & Go"? R: Existe un protocolo "Mix & Go" que proporciona una forma rápida de transformar las células simplemente añadiendo plásmido a las células y sembrando. No se requiere un paso de choque térmico. NEB ha probado nuestras células competentes en este protocolo frente al producto "Mix & Go" de otra empresa. Hemos observado que ambos producen un número similar de colonias; sin embargo, las colonias de NEB son de mayor tamaño utilizando el mismo período de incubación. P: ¿Está la expresión de T7 sujeta a la represión catabólica en BL21(DE3) y cepas derivadas? R: El profago lambda DE3 porta el gen de la ARN polimerasa T7 (T7gene1). La expresión de la ARN polimerasa T7 está controlada por el promotor lacUV5. Por lo tanto, la adición de glucosa provocará la represión de catabolitos y la expresión basal de la proteína de los vectores promotores T7 se controlará mejor cuando la glucosa esté presente en el medio. Cuando el glicerol es la principal fuente de carbono, no debería haber ningún efecto sobre la expresión basal de T7.