New England Biolabs, C2529H, NiCo21(DE3) E. coli competente

¿Tiene problemas para abrir sus tubos? Categorías relacionadas: Purificación de níquel (etiqueta His), Expresión de T7, Purificación por afinidad, Aplicaciones: Expresión y purificación de proteínas etiquetadas con His, Purificación por afinidad y etiquetas de expresión, Expresión de T7, Especificaciones : Antibiótico para la selección de plásmidos. Antibióticos para la selección de plásmidos. Concentración de trabajo: Ampicilina 100 µg/ml. Carbenicilina 100 µg/ml. Cloranfenicol 33 µg/ml. Kanamicina 30 µg/ml. Estreptomicina 25 µg/ml. Tetraciclina 15 µg/ml. Notas de envío: Envío en hielo seco. Preguntas frecuentes : P: ¿Ofrece New England Biolabs cepas de E. coli competentes aptas para la expresión de proteínas? R: Sí, disponemos de varias cepas para la expresión de proteínas. BL21(DE3) (NEB #C2527) se ofrece para la expresión rutinaria de T7 y BL21 (NEB #C2530) para la expresión no T7. NEBExpress (NEB #C2523) es un derivado mejorado de BL21 y NEB Express Iq (NEB #C3037) ofrece una expresión estrictamente controlada a partir de vectores con promotores lac, tac, trc o T5-lac0. T7 Express Competent E. coli (NEB #C2566) y T7 Express Iq Competent E. coli (NEB #C3016) son derivados mejorados de BL21(DE3). La cepa lacIq permite un control más estricto de la expresión. Ambas están disponibles con la función lysY para un control excepcional de la expresión. (T7 Express lysY, NEB #C3010 y T7 Express lysY/Iq, NEB #C3013). NEB también ofrece cepas SHuffle™ capaces de plegar correctamente proteínas con múltiples enlaces disulfuro en el citoplasma. SHuffle™ Express (NEB #C3028H) puede utilizarse con promotores distintos de T7 o SHuffle™ Express T7 (NEB #C3029H) para vectores de expresión del promotor T7. Para la expresión del promotor T7 tóxico, SHuffle™ Express T7 lysY (NEB #C3030H) es ideal. Estas tres cepas también se ofrecen como cepas K12: SHuffle™ (NEB #C3025H), SHuffle™ T7 (NEB #C3026H) y SHuffle™ T7 lysY (NEB #C3027H). Lemo21(DE3) (NEB #C2528) está disponible para la expresión ajustable de dianas complejas, como proteínas de membrana, proteínas tóxicas y proteínas con tendencia a la expresión insoluble. NiCo21(DE3) (NEB #C2529) está diseñado para la expresión y purificación rutinaria de proteínas marcadas con His. P: ¿Cuáles son las soluciones/recetas (C2529)? R: SOB: 2% peptona vegetal (o triptona) 0,5% extracto de levadura 10 mM NaCl 2,5 mM KCl 10 mM MgCl2 10 mM MgSO4SOC:SOB + 20 mM glucosa Agar LB: 1% triptona 0,5% extracto de levadura 0,17 M NaCl 1,5% agar P: ¿Por qué no hay colonias o no hay crecimiento en el cultivo líquido (C2529)? R: Este resultado a menudo se debe a la expresión basal de un producto génico diana, lo cual es perjudicial para la viabilidad celular. La expresión basal de la proteína diana en NiCo21(DE3) es idéntica a la expresión basal en BL21(DE3). Algunos sistemas de vectores (en particular, los que utilizan un promotor T7) permiten la expresión sin inductor. Si se requiere una expresión de T7 estrictamente regulada, utilice una cepa que exprese lysY: T7 Express lysY (NEB #C3010) lysY produce una lisozima T7 mutante que se une a la ARN polimerasa T7, reduciendo la expresión basal de la proteína diana. Tras la inducción, la ARN polimerasa T7 recién formada titula la lisozima y da como resultado la expresión de la proteína diana. T7 Express lysY/Iq (NEB #C3013) expresión de lysY, así como sobreexpresión de lacI para reprimir la expresión basal de la ARN polimerasa T7. Lemo21(DE3) (NEB #C2528) BL21(DE3) que contiene el Lemo System™. La expresión de LysY está modulada por L-ramnosa, lo que hace que la expresión de la proteína T7 esté estrictamente regulada y sea ajustable. P: ¿Por qué la proteína inducida es insoluble (C2529)? R: La expresión de T7 a menudo conduce a una producción muy alta de proteína que puede resultar en que la proteína diana se vuelva insoluble. Las posibles soluciones son: Inducir a una temperatura más baja (tan baja como 15 °C durante la noche) Reducir la concentración de IPTG a 10–40 µM Inducir más temprano en la fase de crecimiento (OD600 = 0,3 o 0,4) y cosechar las células antes. Crear un constructo de expresión donde la proteína diana se fusione a la proteína de unión a maltosa (NEB #E8200). P: ¿Por qué no hay proteína visible por SDS-PAGE o no hay actividad (C2529)? R: Verifique la toxicidad: la ausencia de proteína puede significar que las células han perdido el plásmido de expresión o que se han eliminado elementos del plásmido de expresión. Cultivar células para la inducción de proteínas. Justo antes de la inducción, sembrar una muestra en placas duplicadas con y sin selección de antibióticos. Si la toxicidad es un problema, habrá una diferencia significativa entre el número de colonias en las placas. Se observarán menos colonias en placas que contienen antibiótico (lo que indica que el plásmido se ha perdido) en comparación con las placas sin antibiótico. Si el plásmido de expresión no se mantiene mediante la selección del fármaco, las cepas lysY mejorarán la estabilidad del clon. Compruebe la integridad del clon mediante análisis de enzimas de restricción o secuenciación del ORF. P: ¿Cuáles son las propiedades de la cepa (C2529)? R: Las propiedades de esta cepa que contribuyen a su utilidad como cepa de expresión de proteínas se describen a continuación. ARN polimerasa T7: El gen 1 de T7 está codificado por el profago lambda DE3 presente en el cromosoma. La ARN polimerasa T7 se expresa a partir del promotor lacUV5, que es menos sensible a la represión por catabolitos que el promotor wt lac. Por lo tanto, las cepas DE3 pueden exhibir una expresión de proteína diana no inducida. Aunque λ DE3 normalmente está latente en el cromosoma del huésped, la inducción de la respuesta SOS puede ocurrir como resultado de la expresión de proteínas que dañan el cromosoma de E. coli, ya sea directa o indirectamente. Esto puede conducir a la lisis celular. Las cepas T7 Express no portan el profago DE3 y toleran mejor una respuesta SOS. Deficiencia de proteasa ([lon] ompT): Las cepas de E. coli B presentan deficiencia natural de la proteasa Lon, que en las cepas K-12 sirve para degradar proteínas mal plegadas e impedir la acumulación de proteínas específicas del ciclo celular. La proteasa OmpT reside en la superficie de la E. coli silvestre, tanto en las cepas K-12 como B, lo que presumiblemente ayuda a las células a obtener aminoácidos de su entorno externo. Las células deficientes en ambas proteasas son mucho más susceptibles a la producción de proteínas a partir de genes clonados. Resistencia a fagos T1 (fhuA2): T1, un fago extremadamente virulento, requiere el receptor de captación de hidroxamato férrico de E. coli para su infectividad. La deleción de este gen confiere resistencia a este tipo de fago, pero no afecta significativamente las características de transformación o crecimiento de la célula. glmS6Ala: El gen glmS (glucosamina sintetasa) está mutado y la proteína GlmS expresada (67 kDa) contiene seis sustituciones de histidina a alanina (posiciones 62, 65, 432, 436, 466, 467). La proteína GlmS mutada no se une a la resina Ni-NTA en presencia de 20 mM de tampón de unión/lavado de imidazol, mientras que la proteína GlmS wt se une a la resina Ni-NTA y no se eluye hasta que la concentración de imidazol está dentro de 55-80 mM (1). arnA::CBD El gen arnA (modificación del lípido A) se fusiona con un ORF de B. circulans que codifica un dominio de unión a quitina. La proteína de fusión expresada es de 82 kDa mientras que la proteína wt ArnA es de 74 kDa.can::CBD El gen can (anhidrasa carbónica) está fusionado con un ORF de B. circulans que codifica un dominio de unión a quitina. La proteína de fusión expresada es de 32 kDa mientras que la anhidrasa carbónica wt es de 25 kDa.slyD::CBD El gen slyD (prolil isomerasa de tipo FKBP) está fusionado con un ORF de B. circulans que codifica un dominio de unión a quitina. La proteína de fusión expresada es de 28 kDa. Sin embargo, la masa aparente de la fusión CBD es de aproximadamente 35 kDa cuando se analiza por SDS-PAGE. La masa calculada de wt SlyD es de 21 kDa, mientras que la masa aparente es de 28 kDa. La proteína GlmS(6Ala) y las proteínas marcadas con CBD son funcionales in vivo según los ensayos realizados en New England Biolabs. P: ¿Puedo almacenar células competentes a -20 °C en lugar de -80 °C? R: Las células competentes deben almacenarse a -80 °C. El almacenamiento a -20 °C resultará en una disminución significativa en la eficiencia de transformación (TE). Cuando se probó en NEB 5-alpha Competent E. coli (NEB #C2987H), las células perdieron el 94,5 % de TE después de solo 24 horas de almacenamiento a -20 °C. Las células perdieron el 98,9 % de TE después de 2 días y el 99,6 % de TE después de una semana de almacenamiento a -20 °C. P: ¿Qué tipo de tubos de transformación se deben usar? R: En comparación con el tubo de 2,0 ml proporcionado con las células competentes de formato de un solo uso de NEB, el tubo Eppendorf de 1,5 ml que probamos funcionó bien. P: ¿Qué volumen de ADN se puede agregar a las células competentes? R: El volumen de ADN que se agrega a las células competentes afecta la eficiencia de transformación. Se recomiendan de 1 a 5 µl de ADN (plásmido o producto de ligación) para 50 µl de células competentes. En 50 µl de células competentes, la eficiencia de transformación disminuye al 52 % cuando el volumen de ADN aumenta de 2 µl a 10 µl. La eficiencia de transformación disminuye al 18 % cuando el volumen de ADN aumenta de 2 µl a 20 µl. La eficiencia de transformación disminuye al 5,2 % cuando el volumen de ADN aumenta de 2 µl a 50 µl. P: ¿Cuál es la vida útil de esta cepa (NEB n.° C2529H)? R: La fecha de caducidad es de un año a partir de la fecha de ensayo proporcionada con el producto. P: ¿Son las células competentes de NEB compatibles con el protocolo "Mix & Go"? R: Existe un protocolo "Mix & Go" que proporciona una forma rápida de transformar las células simplemente añadiendo plásmido a las células y sembrando en placa. No se requiere un paso de choque térmico. NEB ha probado nuestras células competentes en este protocolo contra el producto "Mix & Go" de otra compañía. Hemos observado que ambos producen cantidades similares de colonias; sin embargo, las colonias de NEB son más grandes en tamaño utilizando el mismo período de incubación. P: ¿Cómo debo almacenar el medio de crecimiento SOC? El SOC que recibí con mis células competentes recomienda almacenarlo a temperatura ambiente o a 4 °C; sin embargo, al comprarlo como producto independiente, recomienda almacenarlo a 4 °C. ¿Cuál es mejor? R: El medio SOC se puede almacenar a 4 °C o a temperatura ambiente, dependiendo de la rapidez con la que se vaya a usar. Almacenar a temperatura ambiente es conveniente y adecuado para uso a corto plazo (de semanas a un par de meses). Para almacenamiento a largo plazo, recomendamos almacenarlo a 4 °C. Tenga en cuenta que el medio de crecimiento 1.5 suministrado con NEB #C2987R (formato de placa de 1 x 384 pocillos) solo debe almacenarse a temperatura ambiente o se formarán cristales. P: ¿Está la expresión de T7 sujeta a represión catabólica en BL21(DE3) y cepas derivadas? R: El profago lambda DE3 porta el gen de la ARN polimerasa T7 (T7gene1). La expresión de la ARN polimerasa T7 está controlada por el promotor lacUV5. Por lo tanto, la adición de glucosa resultará en represión catabólica y la expresión proteica basal de los vectores promotores T7 se controlará mejor cuando la glucosa esté presente en el medio. Cuando el glicerol es la fuente principal de carbono, no debería haber ningún efecto en la expresión proteica basal de T7. P: ¿Qué plásmidos de expresión se pueden usar con NiCo21(DE3)? R: NiCo21(DE3) está diseñado para la expresión proteica de vectores que codifican el promotor del fago T7. Sin embargo, NiCo21(DE3) también es compatible con cualquier promotor reconocido por la ARN polimerasa de E. coli, como Plac, Ptac, Ptrc, ParaBAD, PrhaBAD y PT5-lac. El vector pUC19 se suministra como control para probar la eficiencia de la transformación. pUC19 codifica un promotor lac pero debido al alto número de copias no recomendamos pUC19 para la expresión de proteínas.