New England Biolabs, C2530H, BL21 E. coli competente

¿Tiene problemas para abrir sus tubos? Categorías relacionadas Expresión no T7,, Cepas de expresión de proteínas de E. coli,, E. coli, Cepas de expresión, Aplicaciones Expresión no T7,, Expresión de proteínas en, E. coli,,, Especificación de expresión de proteínas Antibiótico para la selección de plásmidos Antibióticos para la selección de plásmidos Concentración de trabajo Ampicilina 100 µg/ml Carbenicilina 100 µg/ml Cloranfenicol 33 µg/ml Kanamicina 30 µg/ml Estreptomicina 25 µg/ml Tetraciclina 15 µg/ml Notas de envío Envío en hielo seco Preguntas frecuentes P: ¿Ofrece New England Biolabs cepas de E. coli competentes adecuadas para la expresión de proteínas? R: Sí, tenemos varias cepas para la expresión de proteínas. BL21(DE3) (NEB #C2527) se ofrece para la expresión rutinaria de T7 y BL21 (NEB #C2530) para la expresión no T7. NEBExpress (NEB #C2523) es un derivado mejorado de BL21 y NEB Express Iq (NEB #C3037) ofrece una expresión estrictamente controlada a partir de vectores con promotores lac, tac, trc o T5-lac0. T7 Express Competent E. coli (NEB #C2566) y T7 Express Iq Competent E. coli (NEB #C3016) son derivados mejorados de BL21(DE3). La cepa lacIq permite un control más estricto de la expresión. Ambas están disponibles con la función lysY para un control excepcional de la expresión. (T7 Express lysY, NEB #C3010 y T7 Express lysY/Iq, NEB #C3013). NEB también ofrece cepas SHuffle™ capaces de plegar correctamente proteínas con múltiples enlaces disulfuro en el citoplasma. SHuffle™ Express (NEB #C3028H) puede utilizarse con promotores distintos de T7 o SHuffle™ Express T7 (NEB #C3029H) para vectores de expresión del promotor T7. Para la expresión del promotor T7 tóxico, SHuffle™ Express T7 lysY (NEB #C3030H) es ideal. Estas tres cepas también se ofrecen como cepas K12: SHuffle™ (NEB #C3025H), SHuffle™ T7 (NEB #C3026H) y SHuffle™ T7 lysY (NEB #C3027H). Lemo21(DE3) (NEB #C2528) está disponible para la expresión ajustable de dianas complejas, como proteínas de membrana, proteínas tóxicas y proteínas con tendencia a la expresión insoluble. NiCo21(DE3) (NEB n.° C2529) está diseñado para la expresión y purificación rutinarias de proteínas marcadas con His. P: ¿Cuáles son las soluciones/recetas (C2530)? R: SOB: 2 % de peptona vegetal (o triptona), 0,5 % de extracto de levadura, 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 10 mM de MgCl₂, 10 mM de MgSO₄, SOC:SOB + 20 mM de glucosa, agar LB: 1 % de triptona, 0,5 % de extracto de levadura, 0,17 M de NaCl, 1,5 % de agar. P: ¿Cuáles son las propiedades de la cepa (C2530)? A: Las propiedades de esta cepa que contribuyen a su utilidad como cepa de expresión proteica se describen a continuación. Deficiencia de proteasa ([lon] ompT): Las cepas de E. coli B presentan deficiencia natural de la proteasa lon, que en las cepas K-12 sirve para degradar proteínas mal plegadas e impedir la acumulación de proteínas específicas del ciclo celular. La proteasa OmpT reside en la superficie de la E. coli silvestre, tanto en las cepas K-12 como B, lo que presumiblemente ayuda a las células a obtener aminoácidos de su entorno externo. Las células deficientes en ambas proteasas son mucho más susceptibles a la producción de proteínas a partir de genes clonados. Fago resistente T1 (fhuA2): T1, un fago extremadamente virulento, requiere el receptor de captación de hidroxamato férrico de E. coli para su infectividad. La deleción de este gen confiere resistencia a este tipo de fago, pero no afecta significativamente las características de transformación o crecimiento de la célula. P: ¿Por qué no hay colonias o no hay crecimiento en el cultivo líquido (C2530)? R: Este resultado puede deberse a la expresión basal de un producto génico diana, lo cual es perjudicial para la viabilidad celular. Si se sospecha toxicidad de la proteína diana, se recomiendan cepas que sobreproducen LacI (p. ej., NEB #C3037 NEB Express Iq Competent E. coli) para vectores que contienen un promotor tac, trc, lac, lacUV5 o T5-lacO. P: ¿Por qué la proteína inducida es insoluble (C2530)? R: La expresión de alto nivel de genes no nativos a menudo da como resultado que la proteína diana se vuelva insoluble. Las posibles soluciones son: Inducir a una temperatura más baja (tan baja como 15 °C durante la noche) Reducir la concentración de IPTG a 40 μM Inducir más temprano en la fase de crecimiento (OD600 = 0,3–0,4) y cosechar las células antes. Crear un constructo de expresión donde la proteína diana se fusione a la proteína de unión a maltosa (pMAL Protein Fusion and Purification System, NEB #E8200). P: ¿Por qué no se observa proteína en el gel o no hay actividad (C2530)? R: Compruebe la toxicidad: la ausencia de proteína puede indicar que las células han perdido el plásmido de expresión o que se han eliminado elementos del plásmido de expresión. Cultive las células para la expresión de la proteína. Justo antes de la inducción, sembrar una muestra en placas duplicadas con y sin selección con antibiótico. Si la toxicidad es un problema, habrá una diferencia significativa entre el número de colonias en las placas. Se observarán menos colonias en las placas con antibiótico (lo que indica que se ha perdido el plásmido) en comparación con las placas sin antibiótico. Compruebe la integridad del clon mediante análisis de enzimas de restricción o secuenciación del ORF. P: ¿Puedo almacenar células competentes a -20 °C en lugar de -80 °C? R: Las células competentes deben almacenarse a -80 °C. El almacenamiento a -20 °C resultará en una disminución significativa de la eficiencia de transformación (ET). Cuando se probó en NEB 5-alpha Competent E. coli (NEB #C2987H), las células perdieron el 94,5% de TE después de solo 24 horas de almacenamiento a -20 °C. Las células perdieron el 98,9% de TE después de 2 días y el 99,6% de TE después de una semana de almacenamiento a -20 °C. P: ¿Qué tipo de tubos de transformación se deben usar? R: En comparación con el tubo de 2,0 ml proporcionado con células competentes de formato de un solo uso NEB, el tubo Eppendorf de 1,5 ml que probamos funcionó bien. P: ¿Qué volumen de ADN se puede agregar a las células competentes? R: El volumen de ADN que se agrega a las células competentes afecta la eficiencia de la transformación. Se recomiendan de 1 a 5 µl de ADN (plásmido o producto de ligación) para 50 µl de células competentes. En 50 µl de células competentes, la eficiencia de la transformación cae al 52% cuando el volumen de ADN se aumenta a 10 µl (de 2 µl). La eficiencia de transformación disminuye al 18 % cuando el volumen de ADN aumenta de 2 µl a 20 µl. La eficiencia de transformación disminuye al 5,2 % cuando el volumen de ADN aumenta de 2 µl a 50 µl. P: ¿Cuál es la vida útil de esta cepa (NEB n.° C2350H)? R: La fecha de caducidad es de un año a partir de la fecha de ensayo proporcionada con el producto. P: ¿Son las células competentes de NEB compatibles con el protocolo "Mix & Go"? R: Existe un protocolo "Mix & Go" que proporciona una forma rápida de transformar las células simplemente añadiendo plásmido a las células y sembrando. No se requiere un paso de choque térmico. NEB ha probado nuestras células competentes en este protocolo frente al producto "Mix & Go" de otra empresa. Hemos observado que ambos producen un número similar de colonias; sin embargo, las colonias de NEB son de mayor tamaño utilizando el mismo período de incubación. P: ¿Cuál es la diferencia entre las células de E. coli competentes BL21 y BL21(DE3)? R: Ambas cepas son cepas B y, por lo tanto, presentan deficiencia de la proteasa Lon (citoplasma) y la proteasa OmpT (membrana externa). Por consiguiente, las cepas B son generalmente preferidas para la expresión de proteínas recombinantes. La designación DE3 significa que las cepas respectivas contienen el lisógeno λDE3, que porta el gen de la ARN polimerasa T7 bajo el control del promotor lacUV5. Se requiere IPTG para inducir al máximo la expresión de la ARN polimerasa T7 y expresar genes recombinantes clonados aguas abajo de un promotor T7. BL21(DE3) es adecuada para la expresión a partir de un promotor T7 o T7-lac, o de promotores reconocidos por la ARN polimerasa de E. coli: p. ej., lac, tac, trc, ParaBAD, PrhaBAD y también el promotor T5. Tenga en cuenta que BL21 no porta el gen de la ARN polimerasa T7 y, por lo tanto, solo es adecuado para la expresión de promotores reconocidos por la ARN polimerasa de E. coli: p. ej., lac, tac, trc, ParaBAD, PrhaBAD y también el promotor T5. P: ¿Cómo debo almacenar el medio de crecimiento SOC? El SOC que recibí con mis células competentes recomienda almacenarlo a temperatura ambiente o a 4 °C; sin embargo, cuando lo compro como producto independiente, recomienda almacenarlo a 4 °C. ¿Cuál es mejor? R: El medio SOC se puede almacenar a 4 °C o a temperatura ambiente, dependiendo de la rapidez con la que se vaya a utilizar. Almacenar a temperatura ambiente es conveniente y adecuado para un uso a corto plazo (de semanas a un par de meses). Para un almacenamiento a largo plazo, recomendamos almacenarlo a 4 °C. Tenga en cuenta que el medio de crecimiento 1.5 suministrado con NEB n.º C2987R (formato de placa de 1 x 384 pocillos) solo debe almacenarse a temperatura ambiente o se formarán cristales.