New England Biolabs, C2566H, T7 Express Competent E. coli (alta eficiencia)

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Los genotipos subyacentes a estas propiedades aparecen entre paréntesis. T7 ARN polimerasa (lacZ::T7 gene1) T7-Express tiene el gen de la ARN polimerasa T7 insertado en el operón lac en el cromosoma de E. coli y se expresa bajo el control del promotor lac. Esta configuración proporciona la inducción controlada de la polimerasa y, en consecuencia, el control inducible de la transcripción de genes aguas abajo del promotor T7. Este sistema ofrece ventajas potenciales sobre cepas como BL21(DE3), que transportan la ARN polimerasa T7 en un profago lisogénico. Aunque λDE3 normalmente está latente en el cromosoma del huésped, la inducción de la cascada SOS puede ocurrir como resultado de la expresión de proteínas que dañan el cromosoma de E. coli, ya sea directa o indirectamente. Esto puede provocar lisis celular. Deficiencia de proteasa ([lon]ompT): Las cepas de E. coli B son naturalmente deficientes en la proteasa lon, que en las cepas K-12 sirve para degradar proteínas mal plegadas e impedir la acumulación de algunas proteínas específicas del ciclo celular. La proteasa OmpT reside en la superficie de la E. coli silvestre, tanto en las cepas K-12 como B, presumiblemente ayudando a las células a obtener aminoácidos de su entorno externo. Las células deficientes en ambas proteasas son mucho más susceptibles a la producción de proteínas a partir de genes clonados. Las mutaciones de otros genes pueden ayudar a mejorar los efectos, a veces perjudiciales, de estos defectos de proteasa (p. ej., sulA, a continuación). Recuperación del daño del ADN (sulA11): las células de E. coli pueden tolerar una cantidad sustancial de daño crónico del ADN siempre que se permita que proceda la reparación. Esta capacidad se ve comprometida si las células no pueden dividirse después de la reparación. En las células lon-, SulA, un inhibidor de la división celular, se acumula y hace que las células se vuelvan hipersensibles al daño del ADN. La mutación sulA introducida en la cepa T7 Express permite que las células se dividan de forma más normal en ausencia de la proteasa Lon. Deficiencia de endonucleasa I: (endA) El espacio periplásmico de las células de E. coli de tipo silvestre contiene una endonucleasa no específica. Se debe tener mucho cuidado para evitar la degradación de los plásmidos preparados a partir de estas células. La mutación endA elimina esta endonucleasa y puede mejorar significativamente la calidad de las preparaciones de plásmidos. Restricción deficiente: (Δ(mcrC-mrr)114::IS10) Las cepas silvestres de E. coli B portan una endonucleasa de restricción de tipo I que escinde el ADN con el sitio TGA(N8)TGCT. Si bien el ADN de E. coli está protegido de la degradación por una metiltransferasa afín, el ADN extraño se corta en estos sitios. La deleción descrita anteriormente elimina tanto la metilasa como la endonucleasa. Deficiente en la restricción de metilo: (Δ((mcrC-mrr)114::IS10 y R(mcr-73::miniTn10--TetS)2): E. coli tiene un sistema de enzimas codificadas por mcrA, mcrBC y mrr que escinde el ADN con patrones de metilación que se encuentran en eucariotas superiores, así como en algunas cepas vegetales y bacterianas. Las tres enzimas Mcr y Mrr se han inactivado en T7 Express, lo que permite la introducción de ADN eucariota de origen genómico (p. ej., bibliotecas primarias) si se desea. Resistente al fago T1: (fhuA2) T1, un fago extremadamente virulento, requiere el receptor de captación de hidroxamato férrico de E. coli para su infectividad. La eliminación de este gen confiere resistencia a este tipo de fago, pero no afecta significativamente las características de transformación o crecimiento de la célula. P: ¿Por qué no hay colonias o no hay crecimiento en el cultivo líquido (C2566)? R: Incluso Aunque la expresión de T7 está estrechamente regulada, puede haber un bajo nivel de expresión basal en el huésped T7 Express. Si es probable la toxicidad de la proteína expresada, se debe realizar la transformación del plásmido de expresión en una de las siguientes cepas: » T7 Express Iq: la sobreexpresión del represor LacI reduce la expresión basal de la ARN polimerasa T7. » T7 Express lysY: la lysY produce lisozima T7 mutante que se une a la ARN polimerasa T7, reduciendo la expresión basal de la proteína diana. Tras la inducción, la ARN polimerasa T7 recién formada titula la lisozima y da lugar a la expresión de la proteína diana. » T7 Express Iq/lysY combina ambos efectos anteriores. La incubación a 30 °C o a temperatura ambiente también puede aliviar los problemas de toxicidad. Además, verifique la concentración de antibiótico (pruebe con el plásmido de control). P: ¿Por qué no hay proteína visible en el gel o no hay actividad (C2566)? R: Verifique la toxicidad: la ausencia de proteína puede significar que las células han eliminado elementos en la expresión. Plásmido. » Cultive células para la inducción de proteínas. Justo antes de la inducción, sembrar una muestra en placas duplicadas con y sin selección de antibiótico. Si la toxicidad es un problema, habrá una diferencia significativa entre el número de colonias en las placas. Se observarán menos colonias en las placas con antibiótico (lo que indica que el plásmido se ha perdido) en comparación con las placas sin antibiótico. » Si la toxicidad es el problema, analice los hospedadores Iq y LysY mencionados anteriormente para reducir la expresión basal. P: ¿Por qué la proteína inducida es insoluble (C2566)? R: Compruebe la insolubilidad; esto es importante porque la expresión de T7 a menudo conduce a una producción muy alta de proteína que puede provocar que la proteína diana se vuelva insoluble. Las posibles soluciones para esto son: » Inducir a temperaturas más bajas (hasta 12-15 °C durante la noche) » Reducir la concentración de IPTG a 0,01-0,1 mM » Inducir durante menos tiempo (tan solo 15 minutos) » Inducir en una etapa más temprana del crecimiento (OD600 = 0,3 o 0,4) P: ¿Puedo almacenar células competentes a ¿-20 °C en lugar de -80 °C? R: Las células competentes deben almacenarse a -80 °C. El almacenamiento a -20 °C resultará en una disminución significativa de la eficiencia de transformación (ET). Al analizarlas con E. coli competente NEB 5-alpha (NEB n.° C2987H), las células perdieron el 94,5 % de ET tras solo 24 horas de almacenamiento a -20 °C. Las células perdieron el 98,9 % de ET tras 2 días y el 99,6 % tras una semana de almacenamiento a -20 °C. P: ¿Cuál es la diferencia entre NEB n.° C2566H y NEB n.° C2566I? R: Son las mismas células con la misma eficiencia, pero se presentan en diferentes formatos. C2566H se presenta en 20 tubos de transformación de un solo uso, cada uno con 50 μl de células competentes. El plásmido o el producto de ligación se pueden añadir directamente a los tubos de transformación para mayor comodidad. C2566I se presenta en 6 Tubos, cada uno con 200 μl de células competentes. Los tubos deben descongelarse en hielo y transferirse 50 μl de células a tubos nuevos antes de la transformación. Cada tubo contiene suficientes células para 4 transformaciones, lo que reduce el costo de cada una. Si realiza 3 o 4 transformaciones a la vez, usar C2566I resulta rentable. No se recomienda volver a congelar las células competentes después de la descongelación, ya que reducirá significativamente la eficiencia de la transformación. P: ¿Cuál es el tiempo óptimo de choque térmico para esta cepa (NEB #C2566H y NEB #C2566I)? R: El choque térmico a 42 °C durante 10-20 segundos produce la mayor eficiencia de transformación para E. coli competente T7 Express (NEB #C2566H y NEB #C2566I). Se espera una pérdida de aproximadamente el 50 % en la eficiencia de la transformación al aplicar el choque térmico durante 80 segundos (consulte la figura en la página principal del producto). P: ¿Cuánto tiempo debo incubar las células en hielo después de que el ADN se haya... ¿Se han añadido (NEB n.° C2566H y NEB n.° C2566I)? R: Se recomienda incubar ADN con células competentes T7 Express en hielo durante 30 minutos. Se espera una pérdida de aproximadamente el 30 % en la eficiencia de transformación al incubar durante 10 minutos (consulte la figura en la página principal del producto). P: ¿Es T7 Express (NEB n.° C2566H y NEB n.° C2566I) compatible con los procedimientos de autoinducción? R: T7 Express no es compatible con los procedimientos de autoinducción. En medios de autoinducción, la lactosa sirve para inducir la expresión de la ARN polimerasa T7 tras la conversión a alo-lactosa por la beta-galactosidasa (el producto del gen lacZ). Por lo tanto, la autoinducción debe realizarse utilizando cepas con un operón lac intacto (1). En la cepa T7 Express, el gen de la ARN polimerasa T7 (gen T7 1) altera el gen lacZ, inactivando la beta-galactosidasa. Por lo tanto, no se recomienda la cepa T7 Express para la autoinducción. Procedimientos. Recomendamos las cepas huésped BL21(DE3) (NEB #C2527H y NEB #C2527I) o NiCo21(DE3) (NEB #C2529H) para procedimientos de autoinducción. (1) Studier, FW (2005) Protein Production by Auto-Induction in High-Density Shaking Cultures Protein Expr. Purif. 41, 207-34. P: ¿Qué tipo de tubos de transformación se deben utilizar? R: En comparación con el tubo de 2,0 ml proporcionado con las células competentes de formato desechable NEB, el tubo Eppendorf de 1,5 ml que probamos funcionó correctamente. P: ¿Qué volumen de ADN se puede añadir a las células competentes? R: El volumen de ADN que se añade a las células competentes afecta la eficiencia de la transformación. Se recomiendan de 1 a 5 µl de ADN (plásmido o producto de ligación) por cada 50 µl de células competentes. En 50 µl de células competentes, la eficiencia de la transformación se reduce al 52 %. cuando el volumen de ADN aumenta a 10 µl (de 2 µl). La eficiencia de transformación disminuye al 18 % cuando el volumen de ADN aumenta a 20 µl (de 2 µl). La eficiencia de transformación disminuye al 5,2 % cuando el volumen de ADN aumenta a 50 µl (de 2 µl). P: ¿Cuál es la vida útil de esta cepa (NEB #C2566H y NEB #C2566I)? R: La fecha de caducidad es de dos años a partir de la fecha de ensayo proporcionada con el producto. P: ¿Son las células competentes de NEB compatibles con el protocolo "Mix & Go"? R: Existe un protocolo "Mix & Go" que proporciona una forma rápida de transformar sus células simplemente agregando plásmido a las células y sembrando. No se requiere un paso de choque térmico. NEB ha probado nuestras células competentes en este protocolo contra el producto "Mix & Go" de otra compañía. Hemos observado que ambos producen un número similar de colonias; sin embargo, las colonias de NEB son de mayor tamaño utilizando el Mismo período de incubación. P: ¿Cuál es la diferencia entre T7 Express (NEB #C2566H/I) y BL21(DE3) (NEB #C2527H/I)? R: T7-Express tiene el gen de la ARN polimerasa T7 insertado en el operón lac del cromosoma de E. coli y se expresa bajo el control del promotor lac. Esta configuración proporciona una inducción controlada de la polimerasa y, en consecuencia, un control inducible de la transcripción de genes aguas abajo del promotor T7. Este sistema ofrece ventajas potenciales sobre cepas como BL21(DE3), que portan la ARN polimerasa T7 en un profago lisogénico. Aunque λDE3 normalmente está latente en el cromosoma del huésped, la inducción de la cascada SOS puede ocurrir como resultado de la expresión de proteínas que dañan el cromosoma de E. coli, ya sea directa o indirectamente. Esto puede provocar lisis celular. P: ¿Cómo debo almacenar el medio de crecimiento SOC? El medio de crecimiento SOC que recibí con mis células competentes recomienda almacenarlo a temperatura ambiente. o 4 °C; sin embargo, cuando lo compro como producto independiente, recomienda almacenarlo a 4 °C. ¿Cuál es mejor? R: El medio SOC se puede almacenar a 4 °C o a temperatura ambiente, dependiendo de la rapidez con la que se vaya a utilizar. Almacenar a temperatura ambiente es conveniente y adecuado para usos a corto plazo (de semanas a un par de meses). Para almacenamiento a largo plazo, recomendamos almacenarlo a 4 °C. Tenga en cuenta que el medio Outgrowth Medium 1.5 suministrado con NEB #C2987R (formato de placa de 1 x 384 pocillos) solo debe almacenarse a temperatura ambiente o se formarán cristales. P: ¿La expresión de T7 está sujeta a la represión catabólica en las cepas NEB T7 Express o SHuffle? R: El gen de la ARN polimerasa T7 se clona en el operón lac cromosómico. Dado que la expresión está controlada por el operón lac wt, la adición de glucosa resultará en la represión catabólica. Por lo tanto, la expresión proteica basal de los vectores promotores T7 se controlará mejor cuando la glucosa esté presente en el medio. Cuando el glicerol es el principal fuente de carbono, no debería haber ningún efecto sobre el operón lac.