New England Biolabs, C2925H, E. coli competente para dam-/dcm

Metiltransferasa deficiente Categorías relacionadas Clonación Cepas celulares competentes Aplicaciones Soluciones de automatización y clonación de alto rendimiento, Especificación de transformación Antibiótico para selección de plásmidos Antibióticos para selección de plásmidos Concentración de trabajo Ampicilina 100 µg/ml Carbenicilina 100 µg/ml Kanamicina 30 µg/ml Tetraciclina 15 µg/ml Notas de envío Envíos en hielo seco Preguntas frecuentes P: ¿Puedo transformar ADN no metilado en E. coli competente para dam-/dcm- (C2925)? R: Sí. pUC19 se transformó y propagó en NEB 5-alfa (pUC19-C2987) y en dam-/dcm- (pUC19-C2925). El plásmido se purificó uno al lado del otro y luego se transformó en E. coli competente para dam-/dcm- (NEB #C2925H), respectivamente. La eficiencia de transformación del ADN metilado pUC19-C2987 fue de 4,54 x 10E6 ufc/μg de pUC19. La eficiencia de transformación del ADN no metilado pUC19-C2925 fue de 1,09 x 10E8 ufc/μg de pUC19, 24 veces superior a la del ADN metilado. P: ¿Ofrece New England Biolabs una cepa de E. coli competente sin metiltransferasa? R: Sí, las células de E. coli competentes dam-/dcm- (NEB n.° C2925H) son células de E. coli químicamente competentes y deficientes en metiltransferasa, aptas para el crecimiento de plásmidos sin metilación dam y dcm. P: ¿Cuánto tiempo debo incubar las células en hielo después de añadir el ADN (NEB n.° C2925H y NEB n.° C2925I)? R: Se recomienda incubar ADN con células competentes para dam-/dcm- en hielo durante 30 minutos. En las pruebas con pUC19, un tiempo de incubación de 20 minutos no afectó la eficiencia de la transformación (véase la figura en la página principal del producto). P: ¿Es dam-/dcm- (NEB #C2925H/C2925I) resistente a la kanamicina? R: NEB #C2925H/C2925I presenta una frecuencia baja pero notable de mutaciones resistentes a la kanamicina. Hemos observado un número bajo y variable de mutantes espontáneos de resistencia a Kan en esta cepa, y también en otra cepa dam-/dcm- disponible comercialmente (Invitrogen INV110). En ambas cepas, aparecen colonias diminutas en placas de Kan con una frecuencia que oscila entre 1 en 10e6 y 1 en 10e7 células. Estas colonias diminutas no crecerán al volver a sembrar en una placa de Kan nueva. Este nivel de resistencia de fondo no debería ser un problema para la transformación rutinaria de plásmidos que contienen KanR. Se desconoce el motivo de la aparición de KanR incompleto, dependiente de la cepa. P: ¿Es menor el rendimiento de ADN utilizando la cepa dam-/dcm- (C2925)? R: No. El plásmido pUC19 se transformó en E. coli competente para dam-/dcm- (NEB #C2925H) y E. coli competente para NEB 5-alpha F' Iq (NEB #C2992H), y el plásmido se purificó en paralelo. No hubo diferencias entre estas dos cepas en cuanto a la calidad o el rendimiento del ADN. El plásmido pBIND también se transformó en E. coli competente para dam-/dcm- (NEB #C2925H) y E. coli competente para NEB 10-beta (NEB #C3019H), y el plásmido se purificó en paralelo. No hubo diferencias entre estas dos cepas en cuanto a la calidad o el rendimiento del ADN. Recomendamos inocular colonias recién cultivadas para la propagación del plásmido. P: ¿Cuáles son las soluciones/recetas (C2925)? A: SOB: 2% peptona vegetal (o triptona) 0,5% extracto de levadura 10 mM NaCl 2,5 mM KCl 10 mM MgCl2 10 mM MgSO4 SOC: SOB + 20 mM glucosa Agar LB: 1% triptona 0,5% extracto de levadura 0,17 M NaCl 1,5% agar P: ¿Cuáles son las propiedades de la cepa (C2925)? R: Las propiedades de esta cepa que contribuyen a su utilidad como cepa de subclonación de proteínas se describen a continuación. Los genotipos subyacentes a estas propiedades aparecen entre paréntesis. dam y dcm deficientes en metilación (dam13::Tn9 (CamR), dcm-6) La mayoría de las cepas de laboratorio de E. coli contienen tanto metilasa Dam como metilasa Dcm. La metilasa Dam transfiere un grupo metilo a la adenina en la secuencia GATC. La metilasa Dcm metila los residuos internos de citosina en las secuencias CCAGG y CCTGG. Varias endonucleasas de restricción no escinden sitios con estas bases modificadas. La cepa damdcm permite el crecimiento y la purificación de ADN sin metilación de Dam y Dcm. Deficiencia de endonucleasa I (endA1): El espacio periplásmico de las células de E. coli de tipo silvestre contiene una endonucleasa inespecífica. Se debe extremar la precaución para evitar la degradación de los plásmidos preparados a partir de estas células. La mutación endA elimina esta endonucleasa y puede mejorar significativamente la calidad de las preparaciones de plásmidos. Restricción deficiente: (hsdR2) Las cepas de E. coli K12 de tipo silvestre portan la endonucleasa de restricción EcoK tipo I que escinde el ADN con los sitios (AAC(N6)GTGC y GCAC(N6)GTT. Si bien el ADN de E. coli está protegido de la degradación por una metiltransferasa cognada, el ADN extraño se cortará en estos sitios. La mutación hsdR2 descrita anteriormente elimina la endonucleasa. Restricción parcialmente deficiente de metilo: (mcrA, mcrB1) E. coli tiene un sistema de enzimas, mcrA, mcrB y mrr, que escinde el ADN con patrones de metilación encontrados en eucariotas superiores, así como algunas cepas vegetales y bacterianas. El ADN derivado de fragmentos de PCR, ADNc o ADN previamente propagado en E. coli no se metilará en estos sitios y no se escindirá. Esta cepa tiene una endonucleasa Mrr funcional y puede no ser adecuada para la clonación directa de eucariotas ADN. Resistente al fago T1: (fhuA31) T1, un fago extremadamente virulento, requiere el receptor de captación de hidroxamato férrico de E. coli para su infectividad. La eliminación de este gen confiere resistencia a este tipo de fago, pero no afecta significativamente las características de transformación ni de crecimiento de la célula. P: ¿Cuál es la diferencia entre NEB #C2925H y NEB #C2925I? R: Son las mismas células con la misma eficiencia, pero se ofrecen en diferentes formatos. C2925H se presenta en 20 tubos de transformación de un solo uso, cada uno con 50 μl de células competentes. El plásmido o el producto de ligación se pueden añadir directamente a los tubos de transformación para mayor comodidad. C925I se presenta en 6 tubos, cada uno con 200 μl de células competentes. Los tubos deben descongelarse en hielo y transferir 50 μl de células a nuevos tubos antes de la transformación. Cada tubo contiene suficientes células para 4 transformaciones con la ventaja de reducir... El costo de cada transformación. Si realiza 3 o 4 transformaciones a la vez, usar C2925I es rentable. No se recomienda volver a congelar las células competentes después de la descongelación, ya que reducirá significativamente la eficiencia de la transformación. P: ¿Cuál es el tiempo óptimo de choque térmico para esta cepa (NEB #C2925H y NEB #C2925I)? R: El choque térmico a 42 °C durante 20-30 segundos da como resultado la mayor eficiencia de transformación para E. coli competente dam-/dcm (NEB #C2925H y NEB #C2925I). La eficiencia de la transformación no es muy sensible a los cambios en el tiempo de choque térmico dentro del rango de 20-60 segundos. Se espera una pérdida de aproximadamente el 20 % en la eficiencia de la transformación al aplicar el choque térmico durante 80 segundos (consulte la figura en la página principal del producto). P: ¿Qué cepa de E. coli competente debo usar para la clonación general? R: La E. coli competente NEB 5-alfa (NEB #C2987) es Un derivado de alta eficiencia de DH5α™, la cepa de clonación estándar de la industria. NEB Turbo Competent E. coli (NEB #C2984) y NEB 5-alpha F'Iq Competent E. coli (NEB #C2992) permiten la clonación de genes potencialmente tóxicos gracias al estricto control de la expresión por lacIq y son adecuados para el cribado azul/blanco. NEB Turbo Competent E. coli (NEB #C2984) ofrece una velocidad inigualable en sus transformaciones, con colonias visibles en tan solo 6,5 horas y capacidad de preparación de plásmidos en 4 horas. NEB 10-beta Competent E. coli (NEB #C3019) es un derivado de DH10B™ y puede utilizarse para transformar plásmidos grandes y BAC. Dam-/dcm- Competent E. coli (NEB #C2925) puede utilizarse para el crecimiento de plásmidos sin metilación. Si la eficiencia de la clonación se ve afectada negativamente por repeticiones... Si se tienen en cuenta los elementos de ADN en el vector o la secuencia de inserción, se recomienda la cepa de E. coli competente estable NEB (NEB n.° C3040). (Consulte el protocolo para clonar ADN con elementos repetidos). ¿No está seguro de qué cepa de clonación elegir? El muestreador de E. coli competente para clonación NEB (NEB n.° C1010) le permite muestrear 4 de nuestras cepas químicamente competentes más populares. P: ¿Por qué las colonias tenían un tamaño diferente después de la transformación de la cepa de E. coli competente para dam-/dcm- (C2925)? R: Dam-/dcm- (NEB n.° C2925H/C2925I) es una cepa mutante de E. coli y la mutación dam afecta a esta cepa de diversas maneras, incluyendo una menor eficiencia de transformación, una menor tasa de crecimiento y una mayor tasa de mutación. Es normal obtener colonias de diferente tamaño para NEB n.° C2925H/C2925I. Esto se observó al transformar pUC19. Se analizaron colonias de ambos tamaños y todas contenían pUC19. Se seleccionó una sola colonia grande y Se agitó en SOB y se sembró en LB/Amp. Nuevamente, colonias grandes y pequeñas fueron visibles a la mañana siguiente. P: ¿Cómo debo calcular la eficiencia de transformación (C2925)? R: La eficiencia de transformación se define como el número de unidades formadoras de colonias (ufc) que se producirían al transformar 1 µg de plásmido en un volumen dado de células competentes. El término es algo engañoso, ya que 1 µg de plásmido rara vez se transforma realmente. En cambio, la eficiencia se calcula rutinariamente transformando 100 pg-1 ng de plásmido superenrollado altamente purificado en condiciones ideales. Si planea calcular la eficiencia para comparar células o ligaduras, tenga en cuenta las múltiples variables que afectan esta métrica. Ecuación de la eficiencia de transformación (ET): E = Colonias/µg/Dilución Colonias = el número de colonias contadas en la placa µg = la cantidad de ADN transformado expresada en µg Dilución = la dilución total del ADN antes de la siembra Ejemplo de cálculo de ETE: Transformar 2 µl (100 pg) de ADN de control pUC19 en 50 µl de células, y se supera el crecimiento añadiendo 950 µl de SOC antes de sembrar 100 µl. Si se cuentan 20 colonias en la placa, la TE es: Colonias = 20 µg ADN = 0,0001 Dilución = 100/1000 = 0,1 TE = 20/0,0001/0,1 = 2 x 106 ufc/µg P: ¿Puedo almacenar células competentes a -20 °C en lugar de a -80 °C? R: Las células competentes deben almacenarse a -80 °C. El almacenamiento a -20 °C resultará en una disminución significativa de la eficiencia de transformación (TE). Al analizarlas con E. coli competente NEB 5-alfa (NEB n.° C2987H), las células perdieron el 94,5 % de la TE después de solo 24 horas de almacenamiento a -20 °C. Células Se perdió el 98,9 % de TE después de 2 días y el 99,6 % después de una semana de almacenamiento a -20 °C. P: ¿Qué tipo de tubos de transformación se deben usar? R: En comparación con el tubo de 2,0 ml que se incluye en las células competentes de un solo uso de NEB, el tubo Eppendorf de 1,5 ml que probamos funcionó correctamente. P: ¿Qué volumen de ADN se puede añadir a las células competentes? R: El volumen de ADN que se añade a las células competentes afecta la eficiencia de la transformación. Se recomiendan de 1 a 5 µl de ADN (plásmido o producto de ligación) para 50 µl de células competentes. En 50 µl de células competentes, la eficiencia de la transformación disminuye al 52 % cuando el volumen de ADN se incrementa a 10 µl (de 2 µl). La eficiencia de la transformación disminuye al 18 % cuando el volumen de ADN se incrementa a 20 µl (de 2 µl). La eficiencia de la transformación disminuye al 5,2 % cuando el volumen de ADN se incrementa a 50 µl. (a partir de 2 µl). P: ¿Cuál es la vida útil de esta cepa (NEB #C2925H y NEB #C2925I)? R: La fecha de caducidad es de un año a partir de la fecha de ensayo proporcionada con el producto. P: ¿Son las células competentes de NEB compatibles con el protocolo "Mix & Go"? R: Existe un protocolo "Mix & Go" que proporciona una forma rápida de transformar las células simplemente añadiendo plásmido a las células y sembrando. No se requiere un paso de choque térmico. NEB ha probado nuestras células competentes en este protocolo contra el producto "Mix & Go" de otra compañía. Hemos observado que ambos producen un número similar de colonias; sin embargo, las colonias de NEB son de mayor tamaño utilizando el mismo período de incubación. P: ¿Cómo debo almacenar el medio de crecimiento SOC? El SOC que recibí con mis células competentes recomienda almacenarlo a temperatura ambiente o a 4 °C; sin embargo, cuando lo compro como producto independiente, recomienda almacenarlo a 4 °C. ¿Cuál es mejor? R: El medio SOC se puede almacenar a 4 °C o temperatura ambiente, según la rapidez con la que se vaya a usar. El almacenamiento a temperatura ambiente es conveniente y adecuado para usos a corto plazo (de semanas a un par de meses). Para almacenamiento a largo plazo, recomendamos almacenar a 4 °C. Tenga en cuenta que el medio de crecimiento 1.5 suministrado con NEB n.° C2987R (formato de placa de 1 x 384 pocillos) solo debe almacenarse a temperatura ambiente; de ​​lo contrario, se formarán cristales. P: ¿Cómo se deben preparar los fragmentos para el ensamblaje con NEBuilder HiFi? R: Los fragmentos se pueden preparar mediante los siguientes métodos: Los fragmentos generados por PCR se pueden limpiar con la columna de PCR Monarch o el kit de limpieza rápida de PCR Exo-CIP si la pureza del amplicón es superior al 95 %. Si se utilizó ADN plasmídico como plantilla durante la PCR, se puede eliminar mediante tratamiento con DpnI si es necesario. Si se observan múltiples bandas, recomendamos optimizar la PCR. Si esto no es posible, se recomienda la purificación en gel. La extracción en gel puede introducir tiocianato de guanidina (del tampón de disolución), lo que puede reducir la eficiencia. de la reacción de ensamblaje. Para minimizar esta contaminación, recorte el corte de gel para poder usar una menor cantidad de tampón de disolución de gel. La digestión con enzimas de restricción de un plásmido puede realizarse seguida de inactivación por calor o purificación en columna. Los fragmentos comerciales pueden resuspenderse en agua sin nucleasas o tampón TE y usarse directamente en la reacción de ensamblaje.