New England Biolabs, C2984H, NEB® Turbo Competent E. coli (Alta Eficiencia)

células con rápido crecimiento de colonias (6,5 horas) Categorías relacionadas Clonación Cepas celulares competentes Aplicaciones Soluciones de automatización y clonación de alto rendimiento, Transformación, Clonación rápida: acelere sus flujos de trabajo de clonación con reactivos de NEB Especificación Antibiótico para selección de plásmidos Antibióticos para selección de plásmidos Concentración de trabajo Ampicilina 100 µg/ml Carbenicilina 100 µg/ml Cloranfenicol 33 µg/ml Kanamicina 30 µg/ml Estreptomicina 25 µg/ml Tetraciclina 15 µg/ml Notas de envío Se envía en hielo seco Preguntas frecuentes P: ¿Qué cepas celulares competentes son compatibles con Gateway® Cloning? R: Las E. coli competentes NEB 5-alfa (NEB n.º C2987) y NEB 10-beta (NEB n.º C3019) se pueden utilizar con Gateway Cloning. P: ¿Afecta el tamaño del plásmido al tamaño de la colonia (C2984)? R: Sí. Transformamos pUC19 (2,7 kb) y un plásmido de 10,5 kb en E. coli competente NEB Turbo (NEB n.° C2984H) uno junto al otro, siguiendo el protocolo de transformación de 5 minutos proporcionado. Tras el crecimiento durante la noche, se encontraron 92 colonias en una placa para la transformación con pUC19, con colonias de 2,06 ± 0,11 mm de diámetro. Se contaron 13 colonias en una placa para la transformación con plásmido de 10,5 kb, con colonias de 1,31 ± 0,41 mm de diámetro. Observe que las colonias que portaban el plásmido más grande eran de menor tamaño en comparación con pUC19. P: ¿Cuánto tiempo puedo purificar el plásmido después de la inoculación de una sola colonia con E. coli competente NEB Turbo (C2984)? R: Al inocular una sola colonia cultivada durante la noche, se puede obtener ADN de minipreparación después de solo 3 horas de crecimiento. El rendimiento de ADN se duplicará tras 4 horas de crecimiento desde la inoculación (véase la figura en la página principal del producto). P: ¿Cuánto tiempo debo incubar las células en hielo tras añadir el ADN (NEB n.° C2984H y NEB n.° C2984I)? R: Se recomienda incubar el ADN con células competentes NEB Turbo en hielo durante 30 minutos. En las pruebas con pUC19, un tiempo de incubación de tan solo 2 minutos no afectó la eficiencia de la transformación (véase la figura en la página principal del producto). P: ¿Cuáles son las propiedades de la cepa (C2984)? R: A continuación se describen las propiedades de esta cepa que contribuyen a su utilidad como cepa de clonación. Los genotipos que determinan estas propiedades aparecen entre paréntesis. Detección azul/blanca: (F' Δ(lacZ)M15 produce un fragmento omega de β-gal; Δ(lac-proAB) elimina el gen β-gal en el cromosoma. pUC19 y plásmidos similares codifican el péptido α de la β-galactosidasa (lacZ). El péptido α se puede combinar con el fragmento omega de la β-galactosidasa que se transporta en el F' (complementación α). Cuando la β-galactosidasa se reconstituye de esta manera, puede escindir X-gal y da como resultado colonias azules en una placa de X-gal. Los insertos clonados en el polienlazador del plásmido interrumpen el gen del péptido α y las colonias son blancas. Recombinación plus: (recA+) E. coli tiene un sistema de reparación que recombinará secuencias homólogas. Aunque los clones genómicos a menudo tienen regiones duplicadas, generalmente son menos de 200 pb. El sistema de reparación RecA no causará reordenamientos ni deleciones en estas circunstancias. Las cepas que mantienen la función recA intacta tienden a ser más sanas y a crecer más rápido que las cepas recA-. Deficiencia de endonucleasa I: (endA1) El espacio periplásmico de las células de E. coli de tipo silvestre contiene una endonucleasa inespecífica. Se debe tener mucho cuidado para evitar la degradación de los plásmidos preparados a partir de estas células. La mutación endA elimina esta endonucleasa y puede mejorar significativamente la calidad de las preparaciones de plásmidos. Deficiencia de restricción: (Δ(hsdS-mcrB)5) Las cepas de E. coli K12 de tipo silvestre portan la endonucleasa de restricción EcoK de tipo I, que escinde el ADN con los sitios (AAC(N6)GTGC y GCAC(N6)GTT). Si bien el ADN de E. coli está protegido de la degradación por una metiltransferasa afín, el ADN extraño se cortará en estos sitios. La deleción de hsdS elimina tanto la endonucleasa como Actividades de metil-β-transferasa de EcoK. Parcialmente deficiente en restricción de metilo: (Δ(hsdS-mcrB)5) E. coli posee un sistema de enzimas codificado por mcrA, mcrB y mrr que escinde el ADN con patrones de metilación típicos en células eucariotas. El ADN derivado de fragmentos de PCR, ADNc o ADN previamente propagado en E. coli no se metilará en estos sitios y no se escindirá. Esta cepa posee endonucleasas McrA y Mrr funcionales y podría no ser adecuada para la clonación directa de ADN eucariota. Sensible al fago M13: (F') La infección por M13 y otros fagos similares requiere las características superficiales de E. coli conferidas por el plásmido F que portan algunas cepas de E. coli. La infección por estos fagos permite la producción de ADN monocatenario y la generación de bibliotecas de presentación en fagos. El plásmido F se modifica con frecuencia para transportar otro ADN útil en la célula [p. ej. Δ(lacZ)M15 en esta línea celular] y, cuando se modifica, se denomina F'. Resistente a fagos T1: (fhuA2) T1, un fago extremadamente virulento, requiere el receptor de captación de hidroxamato férrico de E. coli para su infectividad. La eliminación de este gen confiere resistencia a este tipo de fago, pero no afecta significativamente las características de transformación o crecimiento de la célula. Control del promotor Lac: (lacIq) El represor Lac bloquea la expresión de los promotores lac, tac y trc, frecuentemente transportados por plásmidos de expresión. Si el nivel de represor Lac en células de E. coli no es suficiente para inhibir la expresión a través de estos promotores durante la transformación o el crecimiento celular, incluso niveles bajos de expresión pueden reducir la eficiencia de la transformación y seleccionar en contra de los transformantes deseados. Las moléculas adicionales de represor Lac en las cepas lacIq ayudan a minimizar la actividad del promotor hasta que se añade IPTG. DH5α™ es una marca registrada de Invitrogen Corporation. P: ¿Cómo se ve la curva de crecimiento de las células NEB Turbo en comparación con... ¿DH5α? R: Las células NEB Turbo crecen rápidamente no solo en placas (las colonias son visibles después de 6,5 horas), sino también en medio líquido. En un matraz agitado a 37 °C, las células NEB Turbo alcanzan una DO600 de 6,0 después de 6 horas de crecimiento. En las mismas condiciones, las células DH5α alcanzan una DO600 de 2,3. Al analizarlas en un fermentador, los resultados fueron comparables (véase la figura en la página del producto NEB n.° C2984). P: ¿Cuál es la diferencia entre NEB n.° C2984H y NEB n.° C2984I? R: Son las mismas células con la misma eficiencia, pero se presentan en diferentes formatos. C2984H se presenta en 20 tubos de transformación de un solo uso, cada uno con 50 μl de células competentes. El plásmido o el producto de ligación se pueden añadir directamente a los tubos de transformación para mayor comodidad. C2984I se presenta en 6 tubos, cada uno con 200 μl de células competentes. Los tubos deben Se descongelará en hielo y se transferirán 50 μl de células a tubos nuevos antes de la transformación. Cada tubo contiene suficientes células para 4 transformaciones, lo que reduce el coste de cada una. Si se realizan 3 o 4 transformaciones a la vez, el uso de C2984I resulta rentable. No se recomienda volver a congelar las células competentes después de la descongelación, ya que esto reducirá significativamente la eficiencia de la transformación. P: ¿Cuál es el tiempo óptimo de choque térmico para esta cepa (NEB #C2984H y NEB #C2984I)? R: El choque térmico a 42 °C durante 30-40 segundos produce la mayor eficiencia de transformación para las E. coli competentes NEB Turbo (NEB #C2984H y NEB #C2984I). La eficiencia de la transformación no es muy sensible a los cambios en el tiempo de choque térmico dentro del rango de 10-60 segundos. Se espera una pérdida de aproximadamente el 20 % en la eficiencia de la transformación al aplicar un choque térmico durante 80 segundos (véase la figura en la página principal del producto). P: ¿Qué cepa de competente... ¿Qué E. coli debería usar para la clonación general? R: La E. coli competente NEB 5-alfa (NEB #C2987) es un derivado de alta eficiencia de DH5α™, la cepa de clonación estándar de la industria. La E. coli competente NEB Turbo (NEB #C2984) y la E. coli competente NEB 5-alfa F'Iq (NEB #C2992) permiten la clonación de genes potencialmente tóxicos gracias al estricto control de la expresión por lacIq y son aptas para el cribado azul/blanco. La E. coli competente NEB Turbo (NEB #C2984) ofrece una velocidad inigualable para sus transformaciones, con colonias visibles en tan solo 6,5 horas y capacidad de preparación de plásmidos en 4 horas. La E. coli competente NEB 10-beta (NEB #C3019) es un derivado de DH10B™ y puede utilizarse para transformar plásmidos grandes y BAC. Competente Dam-/dcm- E. coli (NEB #C2925) se puede utilizar para el crecimiento de plásmidos sin metilación. Si la eficiencia de clonación se ve afectada negativamente por elementos repetitivos de ADN en el vector o la secuencia de inserción, se recomienda la E. coli estable competente NEB (NEB #C3040). (Consulte el protocolo para la clonación de ADN con elementos repetidos). ¿No está seguro de qué cepa de clonación elegir? El muestreador de E. coli competente para clonación NEB (NEB #C1010) le permite muestrear 4 de nuestras populares cepas químicamente competentes. P: ¿Cómo debo calcular la eficiencia de transformación (C2984)? R: La eficiencia de transformación se define como el número de unidades formadoras de colonias (ufc) que se producirían al transformar 1 µg de plásmido en un volumen dado de células competentes. El término es algo engañoso, ya que 1 µg de plásmido rara vez se transforma realmente. En cambio, la eficiencia se calcula rutinariamente transformando 100 pg-1 ng de plásmido superenrollado altamente purificado en condiciones ideales. Si planea calcular la eficiencia para comparar células o ligaduras, tenga en cuenta las muchas variables que afectan esta métrica. Ecuación de eficiencia de transformación (ET): Ecuación de eficiencia de transformación (ET): Ecuación de eficiencia de transformación (ET): Ecuación de colonias/µg/dilución Colonias = el número de colonias contadas en la placa µg = la cantidad de ADN transformado expresada en µg Dilución = la dilución total del ADN antes de sembrar Ejemplo de cálculo de EET: Transforme 2 µl (100 pg) de ADN de control pUC19 en 50 µl de células, supere el crecimiento añadiendo 250 µl de SOC y diluya 10 µl hasta 1 ml en SOC antes de sembrar 30 µl. Si cuenta 150 colonias en la placa, la EET es: Colonias = 150 µg ADN = 0,0001 Dilución = 10/300 x 30/1000 = 0,001 EET = 150/0,0001/0,001 = 1,5 x 109 ufc/µg P: ¿Cuáles son las soluciones/recetas (C2984)? R: SOB: 2 % de peptona vegetal (o triptona), 0,5 % de extracto de levadura, 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 10 mM de MgCl₂, 10 mM de MgSO₄, 10 mM de SOC: SOB + 20 mM de glucosa. Agar LB: 1 % de triptona, 0,5 % de extracto de levadura, 0,17 M de NaCl, 1,5 % de agar azul/blanco. Cribado: X-gal, 80 µg/ml de IPTG*, 0,3 mM. *Omitir IPTG para genes potencialmente tóxicos. P: ¿Puedo almacenar células competentes a -20 °C en lugar de a -80 °C? R: Las células competentes deben almacenarse a -80 °C. El almacenamiento a -20 °C provocará una disminución significativa de la transformación. Eficiencia de transformación (TE). Al evaluarse en E. coli competente NEB 5-alpha (NEB n.° C2987H), las células perdieron el 94,5 % de TE tras solo 24 horas de almacenamiento a -20 °C. Las células perdieron el 98,9 % de TE tras 2 días y el 99,6 % tras una semana de almacenamiento a -20 °C. P: ¿Qué tipo de tubos de transformación se deben utilizar? R: En comparación con el tubo de 2,0 ml que se incluye con las células competentes de un solo uso de NEB, el tubo Eppendorf de 1,5 ml que probamos funcionó correctamente. P: ¿Qué volumen de ADN se puede añadir a las células competentes? R: El volumen de ADN que se añade a las células competentes afecta a la eficiencia de transformación. Se recomiendan de 1 a 5 µl de ADN (plásmido o producto de ligación) por cada 50 µl de células competentes. En 50 µl de células competentes, la eficiencia de transformación disminuye al 52 % cuando el volumen de ADN se incrementa a 10 µl (de 2 µl). La eficiencia de transformación disminuye al 18 % cuando el volumen de ADN aumenta a 20 µl (de 2 µl). La eficiencia de transformación disminuye al 5,2 % cuando el volumen de ADN aumenta a 50 µl (de 2 µl). P: ¿Cuál es la vida útil de esta cepa (NEB #C2984H y NEB #C2984I)? R: La fecha de caducidad es de un año a partir de la fecha de ensayo proporcionada con el producto. P: ¿Son las células competentes de NEB compatibles con el protocolo "Mix & Go"? R: Existe un protocolo "Mix & Go" que proporciona una forma rápida de transformar las células simplemente añadiendo plásmido a las células y sembrando. No se requiere choque térmico. NEB ha probado nuestras células competentes en este protocolo frente al producto "Mix & Go" de otra empresa. Hemos observado que ambos producen un número similar de colonias; sin embargo, las colonias de NEB son de mayor tamaño con el mismo período de incubación. P: ¿Cómo debo almacenar SOC Outgrowth? ¿Medio? El medio SOC que recibí con mis células competentes recomienda almacenarlo a temperatura ambiente o a 4 °C; sin embargo, al comprarlo como producto independiente, recomienda almacenarlo a 4 °C. ¿Cuál es mejor? R: El medio SOC se puede almacenar a 4 °C o a temperatura ambiente, dependiendo de la rapidez con la que se vaya a usar. El almacenamiento a temperatura ambiente es conveniente y adecuado para usos a corto plazo (de semanas a un par de meses). Para almacenamiento a largo plazo, recomendamos almacenarlo a 4 °C. Tenga en cuenta que el medio Outgrowth Medium 1.5 suministrado con NEB n.° C2987R (formato de placa de 1 x 384 pocillos) solo debe almacenarse a temperatura ambiente; de ​​lo contrario, se formarán cristales. P: ¿Cómo se deben preparar los fragmentos para el ensamblaje con NEBuilder HiFi? R: Los fragmentos se pueden preparar mediante los siguientes métodos: Los fragmentos generados por PCR se pueden limpiar utilizando la columna de PCR Monarch o el kit de limpieza rápida de PCR Exo-CIP si la pureza del amplicón es superior al 95 %. Si se utilizó ADN plasmídico como plantilla durante la PCR, se puede eliminar. Mediante tratamiento con DpnI si es necesario. Si se observan multibandas, recomendamos optimizar la PCR. Si esto no es posible, se recomienda la purificación en gel. La extracción en gel puede introducir tiocianato de guanidina (del tampón de disolución), lo que puede reducir la eficiencia de la reacción de ensamblaje. Para minimizar esta contaminación, recorte el corte de gel para poder usar una menor cantidad de tampón de disolución. Se puede realizar la digestión con enzimas de restricción de un plásmido, seguida de inactivación por calor o purificación en columna. Los fragmentos comerciales pueden resuspenderse en agua sin nucleasas o tampón TE y usarse directamente en la reacción de ensamblaje. P: ¿Se recomiendan NEB Turbo Competent E. coli (High Efficiency) o NEB Turbo Electrocompetent E. coli para clonar ADN repetitivo o inestable? R: NEB Turbo no presenta una deleción del gen recA. Para clonar ADN repetitivo e inestable, recomendamos NEB Stable Competent E. coli (NEB #C3040).