New England Biolabs, C2987P, NEB® 5-alpha E. coli competente (alta eficiencia)

Categorías relacionadas Clonación de cepas celulares competentes Aplicaciones Aplicaciones de USER® y enzimas termolábiles USER II, USER, ®, Clonación, Soluciones de automatización y clonación de alto rendimiento, Especificación Materiales necesarios pero no suministrados Agua libre de nucleasas (NEB #B1500) Medio LB Placas de agar LB +/- antibiótico X-gal (opcional) IPTG (opcional) Antibiótico para selección de plásmidos Antibióticos para selección de plásmidos Concentración de trabajo Ampicilina 100 µg/ml Carbenicilina 100 µg/ml Cloranfenicol 33 µg/ml Kanamicina 30 µg/ml Estreptomicina 25 µg/ml Tetraciclina 15 µg/ml Notas de envío Se envía en hielo seco Preguntas frecuentes P: ¿Qué cepas celulares competentes son compatibles con Gateway® Cloning? R: Las células de E. coli competentes NEB 5-alfa (NEB n.° C2987) y NEB 10-beta (NEB n.° C3019) se pueden utilizar con Gateway Cloning. P: ¿Puedo almacenar células competentes a -20 °C en lugar de a -80 °C? R: Las células competentes deben almacenarse a -80 °C. El almacenamiento a -20 °C reduce significativamente la eficiencia de transformación (ET). En las pruebas con células de E. coli competentes NEB 5-alfa (NEB n.° C2987H), las células perdieron el 94,5 % de la ET tras solo 24 horas de almacenamiento a -20 °C. Las células perdieron el 98,9 % de la ET tras 2 días y el 99,6 % tras una semana de almacenamiento a -20 °C. P: ¿Cómo puedo aumentar la eficiencia de transformación? A: Se ha demostrado que la adición de β-mercaptoetanol (β-ME) a ​​una concentración final de 24 mM aumenta la eficiencia de transformación de NEB 5-alfa en un 40 %. El efecto en la eficiencia de transformación puede ser diferente cuando se utilizan plásmidos distintos de pUC19. Asegúrese de utilizar β-ME estéril de alta pureza a una concentración madre de 1,5 M. Siga el procedimiento a continuación: Para C2987H: Descongele un tubo de células de E. coli competentes para NEB 5-alfa en hielo durante 10 minutos. Para C2987I: Descongele un tubo de células de E. coli competentes para NEB 5-alfa en hielo hasta que desaparezcan los últimos cristales de hielo. Mezcle suavemente y pipetee con cuidado 50 µl de células en un tubo de transformación en hielo. Añada 0,8 µl de β-ME 1,5 M a 50 µl de células. Golpee suavemente el tubo de 4 a 5 veces para mezclar las células y el β-ME. No agitar con vórtex. Incubar en hielo durante 10 minutos. Añadir 1-5 µl que contengan 1 pg-100 ng de ADN plasmídico a la mezcla celular. Sacudirse el tubo con cuidado de 4 a 5 veces para mezclar las células y el ADN. No agitar con vórtex. Colocar la mezcla en hielo durante 30 minutos. No mezclar. Aplicar un choque térmico exactamente a 42 °C durante exactamente 30 segundos. No mezclar. Colocar en hielo durante 5 minutos. No mezclar. Pipetear 950 µl de SOC a temperatura ambiente en la mezcla. Colocar a 37 °C durante 60 minutos. Agitar vigorosamente (250 rpm) o rotar. Calentar las placas de selección a 37 °C. Mezclar bien las células agitando el tubo e invirtiéndolo, luego realizar varias diluciones seriadas de 10 veces en SOC. Extender 50-100 µl de cada dilución en una placa de selección e incubar durante la noche a 37 °C. Alternativamente, incubar a 30 °C durante 24-36 horas. P: ¿Cuánto tiempo debo incubar las células en hielo después de haber añadido el ADN (NEB n.º C2987H y NEB n.º C2987I)? R: Se recomienda incubar el ADN con células competentes NEB 5-alfa en hielo durante 30 minutos. Espere una pérdida de aproximadamente el 20 % en la eficiencia de transformación cuando se incuba durante 10 minutos (consulte la figura en la página principal del producto). P: ¿Cómo debo calcular la eficiencia de transformación (C2987)? R: La eficiencia de transformación se define como el número de unidades formadoras de colonias (ufc) que se producirían al transformar 1 µg de plásmido en un volumen dado de células competentes. El término es algo engañoso, ya que 1 µg de plásmido rara vez se transforma realmente. En cambio, la eficiencia se calcula rutinariamente transformando 100 pg-1 ng de plásmido superenrollado altamente purificado en condiciones ideales. Si planea calcular la eficiencia para comparar células o ligaduras, tenga en cuenta las diversas variables que afectan esta métrica. Ecuación de eficiencia de transformación (ET): E = Colonias/µg/Dilución Colonias = número de colonias contadas en la placa µg = cantidad de ADN transformado expresada en µg Dilución = dilución total del ADN antes de la siembra. Ejemplo de cálculo de E: Transforme 2 µl (100 pg) de ADN de control pUC19 en 50 µl de células, aumente el crecimiento añadiendo 250 µl de SOC y diluya 10 µl hasta 1 ml en SOC antes de sembrar 30 µl. Si cuenta 150 colonias en la placa, el TE es: Colonias = 150 µg ADN = 0,0001 Dilución = 10/300 x 30/1000 = 0,001 TE = 150/.0001/.001 = 1,5 x 109 ufc/µg P: ¿Cuáles son las soluciones/recetas (C2987)? A: SOB: 2% peptona vegetal (o triptona) 0,5% extracto de levadura 10 mM NaCl 2,5 mM KCl 10 mM MgCl2 10 mM MgSO4 SOC: SOB + 20 mM glucosa Agar LB: 1% triptona 0,5% extracto de levadura 0,17 M NaCl 1,5% agar Cribado azul/blanco: X-gal 80 µg/ml IPTG* 0,3 mM * Omitir IPTG para genes potencialmente tóxicos P: ¿Cuáles son las propiedades de la cepa (C2987)? R: Las propiedades de esta cepa que contribuyen a su utilidad como cepa de clonación se describen a continuación. Los genotipos subyacentes a estas propiedades aparecen entre paréntesis. Cribado azul/blanco (Φ80 Δ(lacZ)M15): codifica el fragmento omega de β-gal; lacX74 elimina el gen β-gal en el cromosoma. pUC19 y otros vectores de clonación codifican el α-péptido de la β-galactosidasa (lacZ). El α-péptido expresado a partir del plásmido puede combinarse con el fragmento omega de la β-galactosidasa, que es expresado por la célula huésped. Cuando la β-galactosidasa se reconstituye de esta manera, puede escindir X-gal y da como resultado colonias azules en una placa de X-gal. Los insertos clonados en el polienlazador del plásmido interrumpen el gen del α-péptido y las colonias son blancas. Recombinación deficiente: (recA1) E. coli tiene un sistema de reparación que recombinará secuencias homólogas. Los clones genómicos a menudo tienen regiones duplicadas, y los reordenamientos mediados por RecA pueden ser problemáticos, particularmente cuando las regiones de homología tienen más de 50 pb. Las cepas con la función RecA eliminada tienden a crecer más lentamente que las cepas recA+. Deficiencia de endonucleasa I (endA1): El espacio periplásmico de las células de E. coli silvestre contiene una endonucleasa inespecífica. Se debe tener mucho cuidado para evitar la degradación de los plásmidos preparados a partir de estas células. La mutación endA elimina esta endonucleasa y puede mejorar significativamente la calidad de las preparaciones de plásmidos. Restricción deficiente: (hsdR17) Las cepas silvestres de E. coli K12 portan una endonucleasa de restricción que escinde el ADN con los sitios (AAC(N6)GTGC y GCAC(N6)GTT). Si bien el ADN de E. coli está protegido de la degradación por una metiltransferasa relacionada, el ADN extraño se cortará en estos sitios. La mutación hsdR elimina esta actividad endonucleasa. Sin embargo, esta cepa tiene sistemas de restricción de metilo funcionales y puede no ser adecuada para la clonación directa de ADN eucariota. Resistente al fago T1: (fhuA2) T1, un fago extremadamente virulento, requiere el receptor de captación de hidroxamato férrico de E. coli para su infectividad. La eliminación de este gen confiere resistencia a este tipo de fago, pero no afecta significativamente las características de transformación o crecimiento de la célula. DH5α™ es una marca registrada de Invitrogen Corporation. P: ¿Cuál es la diferencia entre NEB #C2987H y NEB? #C2987I? R: Son las mismas células con la misma eficiencia, pero se ofrecen en diferentes formatos. El C2987H se presenta en 20 tubos de transformación de un solo uso, cada uno con 50 μl de células competentes. Para mayor comodidad, se puede añadir plásmido o producto de ligación directamente a los tubos de transformación. El C2987I se presenta en 6 tubos, cada uno con 200 μl de células competentes. Los tubos deben descongelarse en hielo y transferirse 50 μl de células a nuevos tubos antes de la transformación. Cada tubo contiene suficientes células para 4 transformaciones, lo que reduce el coste de cada una. Si se realizan 3 o 4 transformaciones a la vez, usar el C2987I resulta rentable. No se recomienda volver a congelar las células competentes después de la descongelación, ya que esto reducirá significativamente la eficiencia de la transformación. P: ¿Cuál es la diferencia entre el NEB #C2988J y el NEB #C2987H? R: Son las mismas células NEB 5-alfa. Disponible en diferentes formatos y eficiencias de transformación. El C2987H es una E. coli competente para NEB 5-alfa con una alta eficiencia de 1-3 x 10E9 ufc/μg de ADN pUC19. El C2988J es una E. coli competente para NEB 5-alfa con una eficiencia de subclonación de >1 x 10E6 ufc/μg de ADN pUC19. El C2987H se presenta en 20 tubos de transformación de un solo uso con 50 μl de células competentes cada uno. Para mayor comodidad, se puede añadir el plásmido o el producto de ligación directamente a los tubos de transformación. El C2988J se presenta en 6 tubos con 400 μl de células competentes cada uno. Los tubos deben descongelarse en hielo y se deben pipetear 50 μl de células en sus propios tubos de transformación antes de la transformación. Cada tubo contiene suficientes células para 8 transformaciones, lo que reduce el coste de cada transformación. Recongelar las células competentes después de la descongelación es... No se recomienda, ya que reducirá significativamente la eficiencia de transformación. P: ¿Cuál es el tiempo óptimo de choque térmico para esta cepa (NEB #C2987H y NEB #C2987I)? R: El choque térmico a 42 °C durante 30 segundos produce la mayor eficiencia de transformación para E. coli competente NEB 5-alfa (NEB #C2987H y NEB #C2987I). Se espera una pérdida de aproximadamente el 60 % en la eficiencia de transformación al aplicar el choque térmico durante 80 segundos (consulte la figura en la página principal del producto). P: ¿Qué tipo de células competentes son adecuadas para la transformación de construcciones de ADN creadas con el ensamblaje Gibson? R: Las construcciones de ADN resultantes son compatibles con la mayoría de las células competentes de E. coli. NEB recomienda utilizar E. coli competente NEB 5-alfa (alta eficiencia, NEB #C2987). Si los productos ensamblados superan los 10 kb, NEB recomienda utilizar E. coli competente NEB 10-beta (alta eficiencia, NEB #C3019). o E. coli electrocompetente NEB 10-beta (NEB #C3020). Si los genes ensamblados contienen secuencias repetitivas, se debe utilizar E. coli competente estable NEB (NEB #C3040). P: ¿Qué cepa de E. coli competente debo utilizar para la clonación general? R: E. coli competente NEB 5-alfa (NEB #C2987) es un derivado de alta eficiencia de DH5α™, la cepa de clonación estándar de la industria. E. coli competente NEB Turbo (NEB #C2984) y E. coli competente NEB 5-alfa F'Iq (NEB #C2992) permiten la clonación de genes potencialmente tóxicos gracias al estricto control de la expresión por lacIq y son aptas para el cribado azul/blanco. E. coli competente NEB Turbo (NEB #C2984) ofrece una velocidad inigualable en las transformaciones, con colonias visibles en tan solo 6,5 horas y preparación de plásmidos. Capacidad después de 4 horas. NEB 10-beta Competent E. coli (NEB #C3019) es un derivado de DH10B™ y se puede utilizar para transformar plásmidos grandes y BAC. Dam-/dcm- Competent E. coli (NEB #C2925) se puede utilizar para el crecimiento de plásmidos sin metilación. Si la eficiencia de la clonación se ve afectada negativamente por elementos repetitivos de ADN en el vector o la secuencia del inserto, se recomienda NEB Stable Competent E. coli (NEB #C3040). (Consulte el protocolo para la clonación de ADN con elementos repetidos). ¿No está seguro de qué cepa de clonación elegir? El NEB Cloning Competent E. coli Sampler (NEB #C1010) le permite muestrear 4 de nuestras populares cepas químicamente competentes. P: ¿Qué tipo de tubos de transformación se deben utilizar? R: En comparación con el tubo de 2,0 ml proporcionado con las células competentes de formato desechable NEB, el tubo Eppendorf de 1,5 ml que probamos funcionó igual de bien. Bien. P: ¿Qué volumen de ADN se puede añadir a las células competentes? R: El volumen de ADN que se añade a las células competentes afecta la eficiencia de la transformación. Se recomiendan de 1 a 5 µl de ADN (plásmido o producto de ligación) por cada 50 µl de células competentes. En 50 µl de células competentes, la eficiencia de la transformación se reduce al 52 % cuando el volumen de ADN se aumenta a 10 µl (de 2 µl). La eficiencia de la transformación se reduce al 18 % cuando el volumen de ADN se aumenta a 20 µl (de 2 µl). La eficiencia de la transformación se reduce al 5,2 % cuando el volumen de ADN se aumenta a 50 µl (de 2 µl). P: ¿Son las células competentes de NEB compatibles con el protocolo "Mix & Go"? R: Existe un protocolo "Mix & Go" que proporciona una forma rápida de transformar las células simplemente añadiendo plásmido a las células y sembrando. No se requiere un paso de choque térmico. NEB ha probado nuestras células competentes en este protocolo frente a las de otra empresa. Producto "Mix & Go". Hemos observado que ambos producen cantidades similares de colonias; sin embargo, las colonias NEB son de mayor tamaño con el mismo periodo de incubación. P: ¿Cuál es la vida útil de esta cepa (NEB n.º C2987H y NEB n.º C2987I)? R: La fecha de caducidad es de un año a partir de la fecha de ensayo proporcionada con el producto. P: ¿Cómo se compara la eficiencia de transformación del formato de placa de 96 pocillos (NEB n.º C2987P) con la de los otros formatos? R: La eficiencia de transformación (ET) del formato de placa de 96 pocillos NEB 5-alpha Competent E. coli (NEB n.º C2987P) es tan alta como la de los otros dos formatos, NEB n.º C2987H y NEB n.º C2987I. Con una concentración de 1–3 x 109 ufc/μg de ADN pUC19, la eficiencia de transformación es 10 veces superior a la de cualquier otra célula competente en formato de placa de 96 pocillos disponible comercialmente. P: ¿Cuál es el tiempo óptimo de choque térmico para la placa de 96 pocillos NEB 5-alpha Competent E. coli (NEB n.° C2987P)? R: Tanto la temperatura como el tiempo del choque térmico son importantes y específicos del volumen y el recipiente de transformación. Con la placa de 96 pocillos proporcionada, 10 segundos a 42 °C son óptimos. Se espera una pérdida de aproximadamente el 40 % en la eficiencia de la transformación al aplicar el choque térmico durante 30 segundos. P: Estoy participando en el concurso iGEM. ¿Tienen algún producto de NEB que deba considerar? R: NEB ofrece la mezcla de ensamblaje de ADN NEBuilder® HiFi (NEB n.° E2621) y las mezclas maestras Golden Gate (NEB n.° E1601 y NEB n.° E1602), que permiten el ensamblaje exitoso de múltiples fragmentos de ADN, independientemente de su longitud. Además, NEB ofrece escalas de ADN, polimerasas de alta fidelidad y células competentes. A lo largo de los años, NEB ha apoyado a muchos equipos de iGEM con materiales donados y apoyo científico. Guía. NEB ha creado esta página para ayudarle a encontrar fácilmente formularios de solicitud, información sobre productos NEB y recursos técnicos útiles (incluidos consejos, guías de resolución de problemas y videos educativos). P: ¿Cuál es el tiempo óptimo de choque térmico para la placa de 384 pocillos NEB 5-alpha Competent E. coli (NEB n.° C2987R)? R: Tanto la temperatura como el tiempo del choque térmico son importantes y específicos del volumen y el recipiente de transformación. Con la placa de 384 pocillos proporcionada, 15 segundos a 42 °C son óptimos. Se espera una pérdida de aproximadamente el 40 % en la eficiencia de la transformación con un choque térmico de 20 segundos. P: ¿Cuál es el tiempo óptimo de choque térmico para la placa de 96 tubos NEB 5-alpha Competent E. coli (NEB n.° C2987U)? R: Tanto la temperatura como el tiempo del choque térmico son importantes y específicos del volumen y el recipiente de transformación. Con la placa de 96 tubos proporcionada, 30 segundos a 42 °C son óptimos. Se espera una pérdida de aproximadamente el 15 %. En la eficiencia de transformación tras un choque térmico de 20 segundos. P: ¿Qué tipo de células competentes son adecuadas para la transformación de las construcciones de ADN creadas con la mezcla maestra de ensamblaje de ADN NEBuilder HiFi? R: Las construcciones de ADN resultantes son compatibles con la mayoría de las células competentes de E. coli. NEB recomienda utilizar E. coli competente NEB 5-alfa (alta eficiencia, NEB n.° C2987). Si los productos ensamblados superan los 15 kb, NEB recomienda utilizar E. coli competente NEB 10-beta (alta eficiencia, NEB n.° C3019) o E. coli electrocompetente NEB 10-beta (NEB n.° C3020). Si los genes ensamblados contienen secuencias repetitivas, se debe utilizar E. coli competente estable NEB (NEB n.° C3040). ¿No está seguro de qué cepa de clonación elegir? El muestreador de E. coli competente para clonación NEB (NEB n.° C1010) le permite muestrear 4 de nuestras populares cepas químicamente competentes. P: ¿Cómo debo almacenar el medio de crecimiento SOC? El medio SOC que recibí con mis células competentes recomienda almacenarlo a temperatura ambiente o a 4 °C; sin embargo, al comprarlo por separado, recomienda almacenarlo a 4 °C. ¿Cuál es mejor? R: El medio SOC se puede almacenar a 4 °C o a temperatura ambiente, dependiendo de la rapidez con la que se vaya a usar. Almacenarlo a temperatura ambiente es conveniente y adecuado para usos a corto plazo (de semanas a un par de meses). Para almacenamiento a largo plazo, recomendamos almacenarlo a 4 °C. Tenga en cuenta que el medio de crecimiento 1.5 suministrado con NEB n.° C2987R (formato de placa de 1 x 384 pocillos) solo debe almacenarse a temperatura ambiente o se formarán cristales. P: ¿Cómo se deben preparar los fragmentos para el ensamblaje con NEBuilder HiFi? R: Los fragmentos se pueden preparar mediante los siguientes métodos: Los fragmentos generados por PCR se pueden limpiar utilizando la columna de PCR Monarch o el kit de limpieza rápida de PCR Exo-CIP si la pureza del amplicón es superior al 95 %. Si el ADN plasmídico fue Si se utiliza como plantilla durante la PCR, puede eliminarse mediante tratamiento con DpnI si es necesario. Si se observan multibandas, se recomienda optimizar la PCR. Si esto no es posible, se recomienda la purificación en gel. La extracción en gel puede introducir tiocianato de guanidina (del tampón de disolución), lo que puede reducir la eficiencia de la reacción de ensamblaje. Para minimizar esta contaminación, recorte el corte de gel para poder utilizar una menor cantidad de tampón de disolución. La digestión de un plásmido con enzimas de restricción puede realizarse seguida de inactivación térmica o purificación en columna. Los fragmentos comercialmente ordenados pueden resuspenderse en agua sin nucleasas o tampón TE y utilizarse directamente en la reacción de ensamblaje.