New England Biolabs, C2988J, E. coli competente NEB® 5-alfa (eficiencia de subclonación)

¿Tiene problemas para abrir sus tubos? Categorías relacionadas Clonación Cepas celulares competentes Aplicaciones Transformación Especificación Antibiótico para selección de plásmidos Antibióticos para selección de plásmidos Concentración de trabajo Ampicilina 100 µg/ml Carbenicilina 100 µg/ml Cloranfenicol 33 µg/ml Kanamicina 30 µg/ml Estreptomicina 25 µg/ml Tetraciclina 15 µg/ml Notas de envío Envío en hielo seco Preguntas frecuentes P: ¿Se puede usar medio LB en lugar de SOC en el paso de crecimiento (C2988)? R: El medio de crecimiento NEB SOC está hecho de peptona libre de animales y ofrece una mayor eficiencia de transformación que el medio LB. Todas las células competentes NEB (excepto las células de E. coli competentes NEB 5-alfa con eficiencia de subclonación [NEB#C2988J, NEB 10-beta competentes [NEB#C3019][NEB#C3020K] y NEB Stable competentes [NEB#C3040]) contienen medio de crecimiento SOC en los kits. El medio de crecimiento SOC también se puede adquirir por separado (NEB #B9020S). P: ¿Se puede utilizar la célula de E. coli competente NEB 5-alfa (eficiencia de subclonación) (NEB #C2988J) para la clonación de fragmentos grandes? R: La eficiencia de transformación de C2988J es >1 x 10E6 ufc/μg de pUC19, que es 1000 veces menor que la de otras células competentes NEB de alta eficiencia (1 x 10E9). Si se transforman 50 μl de células competentes C2988J con 100 pg de pUC19 (2 μl de 50 pg/μl de ADN de control pUC19 [proporcionado en células competentes de alta eficiencia NEB]), se deben agregar 950 μl de LB para el crecimiento (LB solo proporciona una eficiencia de transformación del 28% en comparación con SOC para esta cepa). Si luego se extienden 100 μl en una placa, solo se evidenciarán 2-3 colonias después del crecimiento durante la noche. Solo recomendamos usar células competentes de eficiencia de subclonación (NEB #C2988J) para la transformación de plásmidos o la subclonación de rutina, como la inserción de un fragmento de 1 kb en un vector de 2 kb. Se ha clonado con éxito un inserto de 0,8 kb en pUC19 (2,7 kb) con una eficiencia de transformación de 4,2 X 10E4 ufc/μg de vector pUC19. P: ¿Cuál es la diferencia entre las células NEB n.° C2988J y NEB n.° C2987H? R: Son las mismas células NEB 5-alfa, pero se ofrecen con diferente eficiencia de transformación y formatos. La C2987H es una E. coli competente para NEB 5-alfa con una alta eficiencia de 1-3 x 10E9 ufc/μg de ADN pUC19. La C2988J es una E. coli competente para NEB 5-alfa con una eficiencia de subclonación de >1 x 10E6 ufc/μg de ADN pUC19. La C2987H se presenta en 20 tubos de transformación de un solo uso con 50 μl de células competentes cada uno. El plásmido o el producto de ligación se pueden añadir directamente a los tubos de transformación para mayor comodidad. La C2988J se presenta en 6 tubos con 400 μl de células competentes cada uno. Los tubos deben descongelarse en hielo y pipetear 50 μl de células en sus propios tubos de transformación antes de la transformación. Cada tubo contiene suficientes células para 8 transformaciones, lo que reduce el costo de cada una. No se recomienda volver a congelar las células competentes después de la descongelación, ya que esto reducirá significativamente la eficiencia de la transformación. P: ¿Cuál es el tiempo óptimo de choque térmico para esta cepa (NEB #C2988J)? R: El choque térmico a 42 °C durante 30-40 segundos produce la mayor eficiencia de transformación para E. coli competente NEB 5-alfa (Eficiencia de Subclonación) (NEB #C2988J). Se espera una pérdida de aproximadamente el 40 % en la eficiencia de la transformación al aplicar el choque térmico durante 80 segundos (consulte la figura en la página principal del producto). P: ¿Cuánto tiempo debo incubar las células en hielo después de agregar el ADN (NEB #C2988J)? R: Se recomienda incubar ADN con células competentes NEB 5-alfa (eficiencia de subclonación) en hielo durante 30 minutos. Se espera una pérdida de aproximadamente el 30 % en la eficiencia de transformación al incubar durante 10 minutos (consulte la figura en la página principal del producto). P: ¿Cómo debo calcular la eficiencia de transformación de E. coli competente NEB 5-alfa (eficiencia de subclonación)? R: La eficiencia de transformación se define como el número de unidades formadoras de colonias (ufc) que se producirían al transformar 1 µg de plásmido en un volumen determinado de células competentes. El término es algo engañoso, ya que 1 µg de plásmido rara vez se transforma realmente. En cambio, la eficiencia se calcula rutinariamente transformando 100 pg-1 ng de plásmido superenrollado altamente purificado en condiciones ideales. Si planea calcular la eficiencia para comparar células o ligaduras, tenga en cuenta las numerosas variables que afectan a esta métrica. Ecuación de eficiencia de transformación (TE): TE = Colonias/µg/Dilución Colonias = el número de colonias contadas en la placa µg = la cantidad de ADN transformado expresada en µg Dilución = la dilución total del ADN antes de sembrar Ejemplo de cálculo de TE: Transforme 1 µl (1 µg) de 1 mg/ml de ADN pUC19 en 50 µl de células, supere el crecimiento agregando 950 µl de SOC y diluya 10 µl hasta 1 ml en SOC antes de sembrar 100 µl. Si cuenta 250 colonias en la placa, la TE es: Colonias = 250 µg ADN = 1,0 Dilución = 10/1000 x 100/1000 = 0,001 TE = 250/1/0,001 = 2,5 x 105 ufc/µg P: ¿Cuáles son las soluciones/recetas que necesito para transformar E. coli competente NEB 5-alfa (eficiencia de subclonación)? A: SOB: 2% peptona vegetal (o triptona) 0,5% extracto de levadura 10 mM NaCl 2,5 mM KCl 10 mM MgCl2 10 mM MgSO4 SOC: SOB + 20 mM glucosa Agar LB: 1% triptona 0,5% extracto de levadura 0,17 M NaCl 1,5% agar azul/blanco Screening: X-gal 80 µg/ml IPTG* 0,3 mM *Omitir IPTG para genes potencialmente tóxicos P: ¿Cuáles son las propiedades de la cepa de NEB 5-alpha Competent E. coli (eficiencia de subclonación)? R: Las propiedades de esta cepa que contribuyen a su utilidad como cepa de clonación se describen a continuación. Los genotipos subyacentes a estas propiedades aparecen entre paréntesis. Detección azul/blanca: (Φ80 Δ(lacZ)M15 produce el fragmento omega de la β-galactosidasa (β-gal); (argF-lacZ) elimina el gen de la β-gal en el cromosoma. pUC19 y plásmidos similares codifican el péptido α de la β-gal (lacZ). El péptido α puede combinarse con el fragmento omega de la β-gal que se transporta en f80 (complementación α). Cuando la β-gal se reconstituye de esta manera, puede escindir la 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactosidasa (X-gal) y da como resultado colonias azules en una placa de X-gal. Los insertos clonados en el polienlazador del plásmido interrumpen el gen del péptido α y las colonias son blancas. Recombinación deficiente: (recA1) E. coli tiene un sistema de reparación que Recombinará secuencias homólogas. Los clones genómicos suelen presentar regiones duplicadas, y los reordenamientos mediados por RecA pueden ser problemáticos, especialmente cuando las regiones de homología superan los 50 pb. Las cepas con la función RecA eliminada tienden a crecer más lentamente que las cepas recA+. Deficiencia de endonucleasa I: (endA1) El espacio periplásmico de las células de E. coli de tipo silvestre contiene una endonucleasa inespecífica. Se debe tener mucho cuidado para evitar la degradación de los plásmidos preparados a partir de estas células. La mutación endA elimina esta endonucleasa y puede mejorar significativamente la calidad de las preparaciones de plásmidos. Deficiencia de restricción: (hsdR17) Las cepas de E. coli K12 de tipo silvestre portan una endonucleasa de restricción que escinde el ADN con los sitios AAC(N6)GTGC y GCAC(N6)GTT. Si bien el ADN de E. coli está protegido de la degradación por una metiltransferasa afín, el ADN extraño se corta en estos sitios. La mutación hsdR elimina esta endonucleasa. Actividad. Sin embargo, esta cepa posee sistemas de restricción de metilo funcionales y podría no ser adecuada para la clonación directa de ADN eucariota. Resistente al fago T1: (fhuA2) T1, un fago extremadamente virulento, requiere el receptor de captación de hidroxamato férrico de E. coli para su infectividad. La eliminación de este gen confiere resistencia a este tipo de fago, pero no afecta significativamente las características de transformación o crecimiento de la célula. DH5α™ es una marca registrada de Invitrogen Corporation. P: ¿Puedo almacenar células competentes a -20 °C en lugar de a -80 °C? R: Las células competentes deben almacenarse a -80 °C. El almacenamiento a -20 °C resultará en una disminución significativa de la eficiencia de transformación (ET). Cuando se probó en E. coli competente NEB 5-alfa (NEB #C2987H), las células perdieron el 94,5 % de la ET después de solo 24 horas de almacenamiento a -20 °C. Las células perdieron el 98,9 % de la ET después de 2 días, y 99,6 % de TE tras una semana de almacenamiento a -20 °C. P: ¿Qué tipo de tubos de transformación se deben utilizar? R: En comparación con el tubo de 2,0 ml que se incluye en las células competentes de un solo uso de NEB, el tubo Eppendorf de 1,5 ml que probamos funcionó correctamente. P: ¿Qué volumen de ADN se puede añadir a las células competentes? R: El volumen de ADN que se añade a las células competentes afecta a la eficiencia de la transformación. Se recomiendan de 1 a 5 µl de ADN (plásmido o producto de ligación) para 50 µl de células competentes. En 50 µl de células competentes, la eficiencia de la transformación se reduce al 52 % cuando el volumen de ADN se incrementa a 10 µl (de 2 µl). La eficiencia de la transformación se reduce al 18 % cuando el volumen de ADN se incrementa a 20 µl (de 2 µl). La eficiencia de la transformación se reduce al 5,2 % cuando el volumen de ADN se incrementa a 50 µl (de 2 µl). P: ¿Cuál es la fecha de caducidad? ¿Vida útil de esta cepa (NEB n.° C2988J)? R: La fecha de caducidad es de un año a partir de la fecha de ensayo proporcionada con el producto. P: ¿Son las células competentes de NEB compatibles con el protocolo "Mix & Go"? R: Existe un protocolo "Mix & Go" que proporciona una forma rápida de transformar las células simplemente añadiendo plásmido a las células y sembrando. No se requiere un choque térmico. NEB ha probado nuestras células competentes en este protocolo frente al producto "Mix & Go" de otra empresa. Hemos observado que ambos producen un número similar de colonias; sin embargo, las colonias de NEB son de mayor tamaño con el mismo período de incubación. P: ¿Cómo se deben preparar los fragmentos para el ensamblaje con NEBuilder HiFi? R: Los fragmentos se pueden preparar mediante los siguientes métodos: Los fragmentos generados por PCR se pueden limpiar utilizando la columna de PCR Monarch o el kit de limpieza rápida de PCR Exo-CIP si la pureza del amplicón es superior al 95 %. Si se utilizó ADN plasmídico como plantilla durante la PCR, se puede eliminar mediante tratamiento con DpnI si es necesario. Si Si se observan multibandas, recomendamos optimizar la PCR. Si esto no es posible, se recomienda la purificación en gel. La extracción en gel puede introducir tiocianato de guanidina (del tampón de disolución), lo que puede reducir la eficiencia de la reacción de ensamblaje. Para minimizar esta contaminación, recorte el corte de gel para poder usar una menor cantidad de tampón de disolución. La digestión de un plásmido con enzimas de restricción puede realizarse seguida de inactivación por calor o purificación en columna. Los fragmentos comercialmente ordenados pueden resuspenderse en agua sin nucleasas o tampón TE y usarse directamente en la reacción de ensamblaje.