New England Biolabs, C2992H, NEB® 5-alpha F'Iq Competent E. coli (Alta Eficiencia)

¿Tiene problemas para abrir sus tubos? Categorías relacionadas Clonación Cepas celulares competentes Aplicaciones Soluciones de clonación y automatización de alto rendimiento, Especificación de transformación Antibiótico para selección de plásmidos Antibióticos para selección de plásmidos Concentración de trabajo Ampicilina 100 µg/ml Carbenicilina 100 µg/ml Cloranfenicol 33 µg/ml Kanamicina 30 µg/ml Estreptomicina 25 µg/ml Notas de envío Envío en hielo seco Preguntas frecuentes P: ¿Qué cepas celulares competentes son compatibles con Gateway® Cloning? R: Las cepas de E. coli competentes NEB 5-alfa (NEB n.° C2987) y NEB 10-beta (NEB n.° C3019) se pueden utilizar con Gateway Cloning. P: ¿Afecta el tamaño del plásmido a la eficiencia de la transformación (C2992)? R: Sí. Transformamos una serie de plásmidos con un tamaño que oscilaba entre 2,7 kb (pUC19) y 24 kb en E. coli competentes para NEB 5-alfa F'Iq (NEB n.º C2992H) y E. coli competentes para NEB 10-beta (NEB n.º C3019H) uno al lado del otro. Observamos que la eficiencia de la transformación se vio afectada por el tamaño del plásmido. Las células químicamente competentes para NEB 10-beta se transforman de forma más eficiente con plásmidos grandes que las células NEB 5-alfa F'Iq. P: ¿Cuánto tiempo debo incubar las células en hielo después de añadir el ADN (NEB n.º C2992H y NEB n.º C2992I)? R: Se recomienda incubar el ADN con células competentes para NEB 5-alfa F'Iq en hielo durante 30 minutos. Cuando se probó con pUC19, un tiempo de incubación de 10 minutos no redujo significativamente la eficiencia de la transformación (véase la figura en la página principal del producto). P: ¿Cómo debo calcular la eficiencia de transformación (C2992)? R: La eficiencia de transformación se define como el número de unidades formadoras de colonias (ufc) que se producirían al transformar 1 µg de plásmido en un volumen determinado de células competentes. El término es algo engañoso, ya que 1 µg de plásmido rara vez se transforma realmente. En cambio, la eficiencia se calcula rutinariamente transformando 100 pg-1 ng de plásmido superenrollado altamente purificado en condiciones ideales. Si planea calcular la eficiencia para comparar células o ligaduras, tenga en cuenta las numerosas variables que afectan a esta métrica. Ecuación de eficiencia de transformación (TE): TE = Colonias/µg/Dilución Colonias = el número de colonias contadas en la placa µg = la cantidad de ADN transformado expresada en µg Dilución = la dilución total del ADN antes de sembrar Ejemplo de cálculo de TE: Transforme 2 µl (100 pg) de ADN de control pUC19 en 50 µl de células, supere el crecimiento agregando 250 µl de SOC y diluya 10 µl hasta 1 ml en SOC antes de sembrar 30 µl. Si cuenta 150 colonias en la placa, el TE es: Colonias = 150 µg ADN = 0,0001 Dilución = 10/300 x 30/1000 = 0,001 TE = 150/0,0001/0,001 = 1,5 x 109 ufc/µg P: ¿Cuáles son las soluciones/recetas (C2992)? A: SOB: 2% peptona vegetal (o triptona) 0,5% extracto de levadura 10 mM NaCl 2,5 mM KCl 10 mM MgCl2 10 mM MgSO4 SOC: SOB + 20 mM glucosa Agar LB: 1% triptona 0,5% extracto de levadura 0,17 M NaCl 1,5% agar Cribado azul/blanco: X-gal 80 µg/ml IPTG* 0,3 mM *Omitir IPTG para genes potencialmente tóxicos P: ¿Cuáles son las propiedades de la cepa (C2992)? R: Las propiedades de esta cepa que contribuyen a su utilidad como cepa de clonación se describen a continuación. Los genotipos subyacentes a estas propiedades aparecen entre paréntesis. Cribado azul/blanco: (F' Δ(lacZ)M15) produce fragmento omega de β-gal; Δ(lac-proAB) elimina el gen β-gal en el cromosoma. pUC19 y plásmidos similares codifican el α-péptido de la β-galactosidasa (lacZ). El α-péptido puede combinarse con el fragmento omega de la β-galactosidasa que se transporta en el F' (α-complementación). Cuando la β-galactosidasa se reconstituye de esta manera, puede escindir X-gal y da como resultado colonias azules en una placa de X-gal. Los insertos clonados en el polienlazador del plásmido interrumpen el gen del α-péptido y las colonias son blancas. Recombinación deficiente: (recA1) E. coli tiene un sistema de reparación que recombinará secuencias homólogas. Los clones genómicos a menudo tienen regiones duplicadas, y los reordenamientos mediados por RecA pueden ser problemáticos, particularmente cuando las regiones de homología tienen más de 50 pb. Las cepas con la función RecA eliminada tienden a crecer más lentamente que las cepas recA+. Deficiencia de endonucleasa I (endA1): El espacio periplásmico de las células de E. coli de tipo silvestre contiene una endonucleasa inespecífica. Se debe tener mucho cuidado para evitar la degradación de los plásmidos preparados a partir de estas células. La mutación endA elimina esta endonucleasa y puede mejorar significativamente la calidad de las preparaciones de plásmidos. Restricción deficiente: (hsdR17) Las cepas de E. coli K12 de tipo silvestre portan una endonucleasa de restricción que escinde el ADN con los sitios (AAC(N6)GTGC y GCAC(N6)GTT. Si bien el ADN de E. coli está protegido de la degradación por una metiltransferasa cognada, el ADN extraño se cortará en estos sitios. La mutación hsdR elimina esta actividad de endonucleasa. Sin embargo, esta cepa tiene sistemas de restricción de metilo funcionales y puede no ser adecuada para la clonación directa de ADN eucariota. Sensible al fago M13: (F´) La infección por M13 y otros fagos similares requiere características de superficie de E. coli conferidas por el plásmido F transportado por algunas cepas de E. coli. La infección por estos fagos permite la producción de ADN monocatenario y la generación de bibliotecas de presentación en fagos. El plásmido F se modifica con frecuencia para transportar otro ADN útil en la célula [p. ej., Δ(lacZ)M15 en esta línea celular] y cuando se modifica se denomina F'. Resistente a fagos T1: (fhuA2) T1, un fago extremadamente virulento, requiere el receptor de captación de hidroxamato férrico de E. coli para su infectividad. La eliminación de este gen confiere resistencia a este tipo de fago, pero no afecta significativamente las características de transformación o crecimiento de la célula. Control del promotor Lac: (lacIq) El represor lac bloquea la expresión de los promotores lac, tac y trc, frecuentemente transportados por plásmidos de expresión. Si el nivel de represor lac en células de E. coli no es suficiente para inhibir la expresión a través de estos promotores durante la transformación o el crecimiento celular, incluso niveles bajos de expresión pueden reducir la eficiencia de la transformación y seleccionar en contra de los transformantes deseados. Las moléculas adicionales de represor lac en las cepas lacIq ayudan a minimizar la actividad del promotor hasta que se añade IPTG. DH5α™ es una marca registrada de Invitrogen Corporation. P: ¿Cuál es la diferencia entre NEB #C2992H y NEB #C2992I? R: Son las mismas células con el mismo Eficiencia, pero se ofrece en diferentes formatos. El C2992H se presenta en 20 tubos de transformación de un solo uso, cada uno con 50 μl de células competentes. Para mayor comodidad, se puede añadir plásmido o producto de ligación directamente a los tubos de transformación. El C2992I se presenta en 6 tubos, cada uno con 200 μl de células competentes. Los tubos deben descongelarse en hielo y transferirse 50 μl de células a nuevos tubos antes de la transformación. Cada tubo contiene suficientes células para 4 transformaciones, lo que reduce el coste de cada una. Si se realizan 3 o 4 transformaciones a la vez, el uso del C2992I resulta rentable. No se recomienda volver a congelar las células competentes después de la descongelación, ya que esto reducirá significativamente la eficiencia de la transformación. P: ¿Cuál es el tiempo óptimo de choque térmico para esta cepa (NEB n.° C2992H y NEB n.° C2992I)? R: El choque térmico a 42 °C durante 30 segundos produce la mayor eficiencia de transformación para NEB. E. coli competente 5-alfa F'Iq (NEB #C2992H y NEB #C2992I). Se espera una pérdida de aproximadamente el 70 % en la eficiencia de transformación al aplicar un choque térmico durante 80 segundos (consulte la figura en la página principal del producto). P: ¿Qué cepa de E. coli competente debo usar para la clonación general? R: La E. coli competente NEB 5-alfa (NEB #C2987) es un derivado de alta eficiencia de DH5α™, la cepa de clonación estándar de la industria. Las E. coli competentes NEB Turbo (NEB #C2984) y NEB 5-alfa F'Iq (NEB #C2992) permiten la clonación de genes potencialmente tóxicos gracias al estricto control de la expresión por lacIq y son adecuadas para el cribado azul/blanco. La E. coli competente NEB Turbo (NEB #C2984) ofrece una velocidad inigualable en sus transformaciones, con colonias visibles en tan solo 6,5 segundos. horas y capacidad de preparación de plásmidos después de 4 horas. NEB 10-beta Competent E. coli (NEB #C3019) es un derivado de DH10B™ y se puede utilizar para transformar plásmidos grandes y BAC. Dam-/dcm- Competent E. coli (NEB #C2925) se puede utilizar para el crecimiento de plásmidos sin metilación. Si la eficiencia de la clonación se ve afectada negativamente por elementos repetitivos de ADN en el vector o la secuencia de inserción, se recomienda NEB Stable Competent E. coli (NEB #C3040). (Consulte el protocolo para clonar ADN con elementos repetidos). ¿No está seguro de qué cepa de clonación elegir? El muestreador NEB Cloning Competent E. coli (NEB #C1010) le permite muestrear 4 de nuestras populares cepas químicamente competentes. P: ¿Puedo almacenar células competentes a -20 °C en lugar de -80 °C? R: Las células competentes deben almacenarse a -80 °C. Almacenamiento a Una temperatura de -20 °C provocará una disminución significativa de la eficiencia de transformación (ET). En las pruebas realizadas con E. coli competente NEB 5-alpha (NEB n.° C2987H), las células perdieron el 94,5 % de la ET tras solo 24 horas de almacenamiento a -20 °C. Las células perdieron el 98,9 % de la ET tras 2 días y el 99,6 % tras una semana de almacenamiento a -20 °C. P: ¿Qué tipo de tubos de transformación se deben utilizar? R: En comparación con el tubo de 2,0 ml que se incluye con las células competentes de un solo uso de NEB, el tubo Eppendorf de 1,5 ml que probamos funcionó correctamente. P: ¿Qué volumen de ADN se puede añadir a las células competentes? R: El volumen de ADN que se añade a las células competentes afecta a la eficiencia de transformación. Se recomiendan de 1 a 5 µl de ADN (plásmido o producto de ligación) por cada 50 µl de células competentes. En 50 µl de células competentes, la eficiencia de transformación desciende al 52 % cuando se aumenta el volumen de ADN a 10 µl (de 2 µl). La eficiencia de transformación disminuye al 18 % cuando el volumen de ADN aumenta a 20 µl (de 2 µl). La eficiencia de transformación disminuye al 5,2 % cuando el volumen de ADN aumenta a 50 µl (de 2 µl). P: ¿Cuál es la vida útil de esta cepa (NEB #C2992H y NEB #C2992I)? R: La fecha de caducidad es de un año a partir de la fecha de ensayo proporcionada con el producto. P: ¿Son las células competentes de NEB compatibles con el protocolo "Mix & Go"? R: Existe un protocolo "Mix & Go" que proporciona una forma rápida de transformar sus células simplemente agregando plásmido a las células y sembrando. No se requiere un paso de choque térmico. NEB ha probado nuestras células competentes en este protocolo contra el producto "Mix & Go" de otra compañía. Hemos observado que ambos producen un número similar de colonias; sin embargo, las colonias de NEB son de mayor tamaño utilizando el mismo período de incubación. P: ¿Cómo debo almacenar el medio de crecimiento SOC? El medio SOC que recibí con mis células competentes recomienda almacenarlo a temperatura ambiente o a 4 °C; sin embargo, al comprarlo por separado, recomienda almacenarlo a 4 °C. ¿Cuál es mejor? R: El medio SOC se puede almacenar a 4 °C o a temperatura ambiente, dependiendo de la rapidez con la que se vaya a usar. Almacenarlo a temperatura ambiente es conveniente y adecuado para usos a corto plazo (de semanas a un par de meses). Para almacenamiento a largo plazo, recomendamos almacenarlo a 4 °C. Tenga en cuenta que el medio de crecimiento 1.5 suministrado con NEB n.° C2987R (formato de placa de 1 x 384 pocillos) solo debe almacenarse a temperatura ambiente o se formarán cristales. P: ¿Cómo se deben preparar los fragmentos para el ensamblaje con NEBuilder HiFi? R: Los fragmentos se pueden preparar mediante los siguientes métodos: Los fragmentos generados por PCR se pueden limpiar utilizando la columna de PCR Monarch o el kit de limpieza rápida de PCR Exo-CIP si la pureza del amplicón es superior al 95 %. Si el plásmido... El ADN se utilizó como plantilla durante la PCR; este puede eliminarse mediante tratamiento con DpnI si es necesario. Si se observan múltiples bandas, se recomienda optimizar la PCR. Si esto no es posible, se recomienda la purificación en gel. La extracción en gel puede introducir tiocianato de guanidina (del tampón de disolución), lo que puede reducir la eficiencia de la reacción de ensamblaje. Para minimizar esta contaminación, recorte el corte de gel para poder utilizar una menor cantidad de tampón de disolución. La digestión de un plásmido con enzimas de restricción puede realizarse seguida de inactivación térmica o purificación en columna. Los fragmentos comercialmente ordenados pueden resuspenderse en agua sin nucleasas o tampón TE y utilizarse directamente en la reacción de ensamblaje.