New England Biolabs, C3013I, E. coli competente para T7 Express lysY/Iq (alta eficiencia)

Alta eficiencia químicamente competente Categorías relacionadas Expresión de T7,, Cepas de expresión de proteínas de E. coli,, E. coli, Cepas de expresión, Aplicaciones Expresión de T7,, Expresión de proteínas tóxicas,, Expresión de proteínas de membrana, Especificación Antibiótico para selección de plásmidos Antibióticos para selección de plásmidos Concentración de trabajo Ampicilina 100 µg/ml Carbenicilina 100 µg/ml Kanamicina 30 µg/ml Estreptomicina 25 µg/ml Tetraciclina 15 µg/ml Notas de envío Envíos en hielo seco Preguntas frecuentes P: ¿Por qué no hay colonias o no hay crecimiento en el cultivo líquido (C3013)? R: Aunque la expresión de T7 está estrechamente regulada, puede haber un bajo nivel de expresión basal en el huésped T7 Express. Si es probable que haya toxicidad de la proteína expresada, se debe llevar a cabo la transformación del plásmido de expresión en una de las siguientes cepas: » T7 Express Iq: la sobreexpresión del represor LacI reduce la expresión basal de la ARN polimerasa T7 » T7 Express lysY: la lysY produce lisozima T7 mutante que se une a la ARN polimerasa T7, lo que reduce la expresión basal de la proteína diana. Tras la inducción, la ARN polimerasa T7 recién creada titula la lisozima y da como resultado la expresión de la proteína diana » T7 Express Iq/lysY combina ambos efectos anteriores. La incubación a 30 °C o a temperatura ambiente también puede aliviar los problemas de toxicidad. Además, verifique la concentración de antibiótico (pruebe con el plásmido de control). P: ¿Por qué no hay proteína visible en el gel o no hay actividad (C3013)? R: Verifique la toxicidad: la ausencia de proteína puede significar que las células han eliminado o eliminado elementos en el plásmido de expresión. Cultive células para la inducción de proteínas. Justo antes de la inducción, sembrar una muestra en placas duplicadas con y sin selección de antibiótico. Si la toxicidad es un problema, habrá una diferencia significativa entre el número de colonias en las placas. Se observarán menos colonias en las placas con antibiótico (lo que indica que el plásmido se ha perdido) en comparación con las placas sin antibiótico. P: ¿Por qué la proteína inducida es insoluble (C3013)? R: Comprobar la insolubilidad: esto es importante porque la expresión de T7 a menudo conduce a una producción muy alta de proteína que puede provocar que la proteína diana se vuelva insoluble. Las soluciones para esto son: » Inducir a temperaturas más bajas (hasta 12-15 °C durante la noche) » Reducir la concentración de IPTG a 0,01-0,1 mM » Inducir durante menos tiempo (hasta 15 minutos) » Inducir en una etapa más temprana del crecimiento (DO600 = 0,3 o 0,4) P: ¿Cuáles son las soluciones/recetas (C3013)? A: SOB: 2% peptona vegetal (o triptona) 0,5% extracto de levadura 10 mM NaCl 2,5 mM KCl 10 mM MgCl2 10 mM MgSO4 SOC: SOB + 20 mM glucosa Agar LB: 1% triptona 0,5% extracto de levadura 0,17 M NaCl 1,5% agar P: ¿Puedo almacenar células competentes a -20 °C en lugar de -80 °C? R: Las células competentes deben almacenarse a -80 °C. El almacenamiento a -20 °C resultará en una disminución significativa de la eficiencia de transformación (TE). Cuando se probó en NEB 5-alpha Competent E. coli (NEB #C2987H), las células perdieron el 94,5% de TE después de solo 24 horas de almacenamiento a -20 °C. Las células perdieron el 98,9 % de TE después de 2 días y el 99,6 % de TE después de una semana de almacenamiento a -20 °C. P: ¿Cuál es la diferencia entre NEB #C3013H y NEB #C3013I? R: Son las mismas células con la misma eficiencia, pero se proporcionan en diferentes formatos. C3013H se envasa con 20 tubos de transformación de un solo uso, cada uno con 50 μl de células competentes. El plásmido o el producto de ligación se pueden agregar directamente a los tubos de transformación para mayor comodidad. C3013I se envasa con 6 tubos, cada uno con 200 μl de células competentes. Los tubos deben descongelarse en hielo y 50 μl de células se transfieren a nuevos tubos antes de la transformación. Cada tubo contiene suficientes células para 4 transformaciones con la ventaja de reducir el costo de cada transformación. Si realiza 3 o 4 transformaciones a la vez, usar C3013I es rentable. No se recomienda volver a congelar las células competentes después de la descongelación, ya que esto reducirá significativamente la eficiencia de la transformación. P: ¿Cuáles son las propiedades de la cepa (C3013)? R: Las propiedades de esta cepa que contribuyen a su utilidad como cepa de expresión de proteínas se describen a continuación. Los genotipos subyacentes a estas propiedades aparecen entre paréntesis. ARN polimerasa T7 (lacZ::T7 gene1): T7-Express tiene el gen de la ARN polimerasa T7 insertado en el operón lac en el cromosoma de E. coli y se expresa bajo el control del promotor lac. Esta configuración proporciona una inducción controlada de la ARN polimerasa T7 y, en consecuencia, un control inducible de la transcripción de genes aguas abajo del promotor T7. Este sistema ofrece ventajas potenciales sobre cepas como BL21(DE3), que llevan la ARN polimerasa T7 en un profago lisogénico. Aunque λDE3 normalmente está latente en el cromosoma huésped, la inducción de la cascada SOS puede ocurrir como resultado de la expresión de proteínas que dañan el cromosoma de E. coli, ya sea directa o indirectamente. Esto puede conducir a la lisis celular. Control del promotor Lac (lacIq): El represor lac bloquea la expresión de los promotores lac, tac y trc frecuentemente transportados por plásmidos de expresión. Si el nivel de represor lac en células de E. coli no es suficiente para inhibir la expresión a través de estos promotores durante la transformación o el crecimiento celular, incluso niveles bajos de expresión de genes tóxicos pueden reducir la eficiencia de la transformación y seleccionar en contra de los transformantes deseados. Las moléculas adicionales del represor lac en cepas lacIq ayudan a minimizar la actividad del promotor hasta que se agrega IPTG. Lisozima T7 (lysY): Esta cepa expresa la variante K128Y de la lisozima T7 que carece de actividad amidasa, pero conserva la capacidad de inhibir la ARN polimerasa T7. La expresión basal del gen diana se minimiza sin inhibir la expresión inducida por IPTG. El gen lysY se encuentra en un plásmido miniF de una sola copia. Deficiencia de proteasa ([lon] ompT): Las cepas de E. coli B presentan deficiencia natural de la proteasa lon, que en las cepas K-12 sirve para degradar las proteínas mal plegadas y evitar la acumulación de algunas proteínas específicas del ciclo celular. La proteasa OmpT reside en la superficie de la E. coli silvestre, tanto en las cepas K-12 como B, lo que presumiblemente ayuda a las células a obtener aminoácidos de su entorno externo. Las células deficientes en ambas proteasas son mucho más susceptibles a la producción de proteínas a partir de genes clonados. Recuperación del daño del ADN (sulA11): Las células de E. coli pueden tolerar una cantidad sustancial de daño crónico del ADN siempre que se permita su reparación. Esta capacidad se ve comprometida si las células no pueden dividirse después de la reparación. En las células lon-, SulA, un inhibidor de la división celular, se acumula y provoca hipersensibilidad celular al daño del ADN. La mutación sulA introducida en la cepa T7-Express permite que las células se dividan con mayor normalidad en ausencia de la proteasa Lon. Deficiencia de endonucleasa I (endA1): El espacio periplásmico de las células de E. coli de tipo silvestre contiene la endonucleasa no específica, EndA. Se debe tener extremo cuidado para evitar la degradación de los plásmidos preparados a partir de estas células. La mutación endA elimina esta endonucleasa y puede mejorar significativamente la calidad de las preparaciones de plásmidos. Deficiencia de restricción (Δ(mcrC-mrr)114::IS10): Las cepas de E. coli B de tipo silvestre portan una endonucleasa de restricción de tipo I que escinde el ADN con el sitio TGA(N8)TGCT. Si bien el ADN de E. coli está protegido de la degradación por una metiltransferasa cognada, el ADN extraño se cortará en estos sitios. La deleción descrita anteriormente elimina tanto la metilasa como la endonucleasa. Deficiente en la restricción de metilo (Δ(mcrC-mrr)114::IS10 y R(mcr-73::miniTn10--TetS)2): E. coli posee un sistema de enzimas codificadas por mcrA, mcrBC y mrr que escinde el ADN con patrones de metilación presentes en eucariotas superiores, así como en algunas cepas vegetales y bacterianas. Las tres enzimas Mcr y Mrr se han inactivado en T7 Express, lo que permite la introducción de ADN genómico de dichas células si se desea. Resistente a fagos T1 (fhuA2): T1, un fago extremadamente virulento, requiere el receptor de captación de hidroxamato férrico de E. coli para su infectividad. La eliminación de este gen confiere resistencia a este tipo de fago, pero no afecta significativamente las características de transformación o crecimiento de la célula. P: ¿Cuál es el tiempo óptimo de choque térmico para esta cepa (NEB #C3013H y NEB #C3013I)? R: El choque térmico a 42 °C durante 10 segundos produce la máxima eficiencia de transformación para E. coli T7 Express lysY/Iq competente (NEB n.° C3013H y NEB n.° C3013I). Se espera una pérdida de aproximadamente el 50 % en la eficiencia de transformación con el choque térmico durante 80 segundos (consulte la figura en la página principal del producto). P: ¿Cuánto tiempo debo incubar las células en hielo después de añadir el ADN (NEB n.° C3013H y NEB n.° C3013I)? R: Se recomienda incubar el ADN con células T7 Express lysY/Iq competentes en hielo durante 30 minutos. En las pruebas con pUC19, un tiempo de incubación de tan solo 2 minutos no redujo significativamente la eficiencia de transformación (consulte la figura en la página principal del producto). P: ¿Es T7 Express lysY/Iq (NEB n.° C3013H y NEB n.° C3013I) compatible con los procedimientos de autoinducción? R: T7 Express lysY/Iq no es compatible con los procedimientos de autoinducción. En medios de autoinducción, la lactosa induce la expresión de la ARN polimerasa T7 tras su conversión a alo-lactosa por la beta-galactosidasa (producto del gen lacZ). Por lo tanto, la autoinducción debe realizarse con cepas con un operón lac intacto (1). En la cepa T7 Express lysY/Iq, el gen de la ARN polimerasa T7 (gen T7 1) altera el gen lacZ, inactivando la beta-galactosidasa. Por lo tanto, no se recomienda la cepa T7 Express lysY/Iq para procedimientos de autoinducción. Recomendamos las cepas hospedadoras BL21(DE3) (NEB n.° C2527H y NEB n.° C2527I) o NiCo21(DE3) (NEB n.° C2529H) para procedimientos de autoinducción. (1) Studier, FW (2005) Protein Production by Auto-Induction in High-Density Shaking Cultures Protein Expr. Purif. 41, 207-34. P: ¿Qué tipo de tubos de transformación se deben usar? R: En comparación con el tubo de 2,0 ml proporcionado con células competentes de formato de un solo uso NEB, el tubo Eppendorf de 1,5 ml que probamos funcionó bien. P: ¿Qué volumen de ADN se puede agregar a las células competentes? R: El volumen de ADN que se agrega a las células competentes afecta la eficiencia de la transformación. Se recomiendan de 1 a 5 µl de ADN (plásmido o producto de ligación) para 50 µl de células competentes. En 50 µl de células competentes, la eficiencia de la transformación cae al 52% cuando el volumen de ADN se aumenta a 10 µl (de 2 µl). La eficiencia de la transformación cae al 18% cuando el volumen de ADN se aumenta a 20 µl (de 2 µl). La eficiencia de transformación disminuye al 5,2 % al aumentar el volumen de ADN a 50 µl (de 2 µl). P: ¿Cuál es la vida útil de esta cepa (NEB n.° C3013H y NEB n.° C3013I)? R: La fecha de caducidad es de dos años a partir de la fecha de ensayo proporcionada con el producto. P: ¿Son las células competentes de NEB compatibles con el protocolo "Mix & Go"? R: Existe un protocolo "Mix & Go" que proporciona una forma rápida de transformar las células simplemente añadiendo plásmido a las células y sembrando. No se requiere choque térmico. NEB ha probado nuestras células competentes en este protocolo frente al producto "Mix & Go" de otra empresa. Hemos observado que ambos producen un número similar de colonias; sin embargo, las colonias de NEB son de mayor tamaño con el mismo período de incubación. P: ¿Es necesaria la selección con antibióticos para mantener el plásmido MiniF-lysY-lacIq? R: Aunque el plásmido MiniF porta el gen de resistencia al cloranfenicol, no es necesario añadir cloranfenicol. Si se añade, la concentración final de cloranfenicol debe ser de 10 μg/ml. Niveles superiores a 15 μg/ml afectarán el crecimiento. P: ¿La expresión de T7 está sujeta a represión catabólica en las cepas NEB T7 Express o SHuffle? R: El gen de la ARN polimerasa de T7 se clona en el operón lac cromosómico. Dado que la expresión está controlada por el operón lac wt, la adición de glucosa provocará represión catabólica. Por lo tanto, la expresión proteica basal de los vectores promotores de T7 se controlará mejor cuando la glucosa esté presente en el medio. Cuando el glicerol es la principal fuente de carbono, no debería haber ningún efecto sobre el operón lac.