New England Biolabs, C3019I, NEB® 10-beta E. coli competente (alta eficiencia)

Categorías relacionadas con NEB 10-beta competente Clonación de cepas celulares competentes Aplicaciones Aplicaciones de las enzimas USER® y USER II termolábiles, USER, ®, Clonación, Mutagénesis dirigida al sitio, Especificación Antibiótico para selección de plásmidos Antibióticos para selección de plásmidos Concentración de trabajo Ampicilina 100 µg/ml Carbenicilina 100 µg/ml Cloranfenicol 33 µg/ml Kanamicina 30 µg/ml Tetraciclina 15 µg/ml Notas de envío Envíos en hielo seco Preguntas frecuentes P: ¿Qué cepas celulares competentes son compatibles con Gateway® Cloning? R: Las E. coli competentes NEB 5-alfa (NEB n.º C2987) y NEB 10-beta (NEB n.º C3019) se pueden utilizar con Gateway Cloning. P: ¿Cuáles son las propiedades de la cepa (C3019)? A: Las propiedades de esta cepa que contribuyen a su utilidad como cepa de clonación se describen a continuación. Los genotipos subyacentes a estas propiedades aparecen entre paréntesis. Cribado azul/blanco (Φ80 Δ(lacZ)M15): codifica el fragmento omega de β-gal; lacX74 elimina el gen β-gal en el cromosoma. pUC19 y otros vectores de clonación codifican el péptido α de la β-galactosidasa (lacZ). El péptido α expresado a partir del plásmido puede combinarse con el fragmento omega de la β-galactosidasa, que es expresado por la célula huésped. Cuando la β-galactosidasa se reconstituye de esta manera, puede escindir X-gal y da como resultado colonias azules en una placa de X-gal. Los insertos clonados en el polienlazador del plásmido interrumpen el gen del péptido α y las colonias son blancas. Recombinación deficiente: (recA1) E. coli posee un sistema de reparación que recombina secuencias homólogas. Los clones genómicos suelen presentar regiones duplicadas, y los reordenamientos mediados por recA pueden ser problemáticos, especialmente cuando las regiones de homología superan los 50 pb. Las cepas con la función recA eliminada tienden a crecer más lentamente que las cepas recA+. Deficiencia de endonucleasa I (endA1): El espacio periplásmico de las células de E. coli silvestre contiene una endonucleasa inespecífica. Se debe tener mucho cuidado para evitar la degradación de los plásmidos preparados a partir de estas células. La mutación endA elimina esta endonucleasa y puede mejorar significativamente la calidad de las preparaciones de plásmidos. Restricción deficiente [Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)]: Las cepas de E. coli K12 de tipo silvestre portan una endonucleasa de restricción que escinde el ADN con los sitios (AAC(N6)GTGC y GCAC(N6)GTT. Si bien el ADN de E. coli está protegido de la degradación por una metiltransferasa cognada, el ADN extraño se cortará en estos sitios. La deleción descrita anteriormente elimina tanto la metilasa como la endonucleasa. Restricción deficiente de metilo [mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)]: E. coli tiene un sistema de enzimas, mcrA, mcrB y mrr que escindirán el ADN con patrones de metilación encontrados en eucariotas superiores, así como algunas cepas vegetales y bacterianas. ADN derivado de fragmentos de PCR, ADNc o ADN previamente propagado en E. coli. no se metilará en estos sitios y no se escindirá. Las tres enzimas Mcr se han inactivado en NEB 10-beta, lo que permite la introducción de ADN eucariota de origen genómico (p. ej., bibliotecas primarias) si se desea. Resistente al fago T1 (fhuA): T1, un fago extremadamente virulento, requiere el receptor de captación de hidroxamato férrico de E. coli para su infectividad. La eliminación de este gen confiere resistencia a este tipo de fago, pero no afecta significativamente las características de transformación o crecimiento de la célula. Vea también el episodio 1 de NEB TV para obtener más información sobre biología sintética. P: ¿Cuál es la diferencia entre NEB #C3019H y NEB #C3019I? R: Son las mismas células con la misma eficiencia, pero se proporcionan en diferentes formatos. C3019H se envasa con 20 tubos de transformación de un solo uso, cada uno con 50 μl de células competentes. El plásmido o el producto de ligadura se pueden agregar directamente a los tubos de transformación para mayor comodidad. C3019I se presenta en 6 tubos, cada uno con 200 μl de células competentes. Los tubos deben descongelarse en hielo y transferirse 50 μl de células a tubos nuevos antes de la transformación. Cada tubo contiene suficientes células para 4 transformaciones, lo que reduce el coste de cada una. Si realiza 3 o 4 transformaciones a la vez, usar C3019I resulta rentable. No se recomienda volver a congelar las células competentes después de la descongelación, ya que esto reducirá significativamente la eficiencia de la transformación. P: ¿Cuál es la vida útil de esta cepa (NEB n.° C3019H y NEB n.° C3019I)? R: La fecha de caducidad es de un año a partir de la fecha de ensayo proporcionada con el producto. P: ¿Qué cepa de E. coli competente debo usar para la clonación general? R: La E. coli competente NEB 5-alfa (NEB n.° C2987) es un derivado de alta eficiencia de DH5α™, la cepa de clonación estándar de la industria. Las E. coli competentes NEB Turbo (NEB #C2984) y NEB 5-alpha F'Iq (NEB #C2992) permiten la clonación de genes potencialmente tóxicos gracias al estricto control de la expresión por lacIq y son aptas para el cribado azul/blanco. NEB Turbo (NEB #C2984) ofrece una velocidad inigualable en las transformaciones, con colonias visibles en tan solo 6,5 horas y capacidad de preparación de plásmidos en 4 horas. NEB 10-beta (NEB #C3019) es un derivado de DH10B™ y puede utilizarse para transformar plásmidos grandes y BAC. Dam-/dcm- (NEB #C2925) puede utilizarse para el crecimiento de plásmidos sin metilación. Si la eficiencia de la clonación se ve afectada negativamente por elementos de ADN repetitivos en el vector o la secuencia del inserto, se recomienda la E. coli competente estable NEB. Se recomienda el uso de la cepa NEB n.° C3040. (Consulte el protocolo para clonar ADN con elementos repetidos). ¿No está seguro de qué cepa de clonación elegir? El muestreador de E. coli competente para clonación NEB (NEB n.° C1010) le permite muestrear 4 de nuestras cepas químicamente competentes más populares. P: ¿Afecta el tamaño del plásmido a la eficiencia de la transformación (C3019)? R: Sí. Transformamos una serie de plásmidos con un tamaño de entre 2,7 kb (pUC19) y 24 kb en E. coli competente para NEB 5-alfa (NEB n.° C2987H) y E. coli competente para NEB 10-beta (NEB n.° C3019H) uno junto al otro. Observamos que la eficiencia de la transformación se vio afectada por el tamaño del plásmido. Las células químicamente competentes para NEB 10-beta se transforman con mayor eficiencia con plásmidos grandes que las células NEB 5-alfa (consulte la figura en la página del producto NEB n.° C3019H). NEB 10-beta Se recomiendan las bacterias E. coli competentes para la transformación de plásmidos grandes y productos de ensamblaje grandes generados mediante las reacciones NEBuilder® HiFi, Gibson Assembly® y Golden Gate Assembly. P: ¿Cómo debo calcular la eficiencia de transformación (C3019)? R: La eficiencia de transformación se define como el número de unidades formadoras de colonias (ufc) que se producirían al transformar 1 µg de plásmido en un volumen determinado de células competentes. El término es algo engañoso, ya que 1 µg de plásmido rara vez se transforma realmente. En cambio, la eficiencia se calcula rutinariamente transformando 100 pg-1 ng de plásmido superenrollado altamente purificado en condiciones ideales. Si planea calcular la eficiencia para comparar células o ligaduras, tenga en cuenta las numerosas variables que afectan a esta métrica. Ecuación de la eficiencia de transformación (ET): E = Colonias/µg/Dilución. Colonias = número de colonias contadas en la placa. µg = cantidad de ADN transformado expresada en µg. Dilución = dilución total del ADN antes de la siembra. Cálculo de la E. Ejemplo: Transformar 2 ul (100 pg) de ADN de control pUC19 en 50 ul de células, completar el crecimiento añadiendo 250 ul de medio de crecimiento estable NEB 10-beta y diluir 10 ul hasta 1 ml en medio de crecimiento estable NEB 10-beta antes de sembrar 30 µl. Si se cuentan 150 colonias en la placa, el TE es: Colonias = 150 µg ADN = 0,0001 Dilución = 10/300 x 30/1000 = 0,001 TE = 150/0,0001/0,001 = 1,5 x 109 ufc/µg P: ¿Puedo almacenar células competentes a -20 °C en lugar de a -80 °C? R: Las células competentes deben almacenarse a -80 °C. El almacenamiento a -20 °C resultará en... Una disminución significativa de la eficiencia de transformación (ET). Al analizar E. coli competente NEB 5-alfa (NEB n.° C2987H), las células perdieron el 94,5 % de la ET tras solo 24 horas de almacenamiento a -20 °C. Las células perdieron el 98,9 % de la ET tras 2 días y el 99,6 % tras una semana de almacenamiento a -20 °C. P: ¿Cuál es el tiempo óptimo de choque térmico para esta cepa (NEB n.° C3019H y NEB n.° C3019I)? R: El choque térmico a 42 °C durante 20-30 segundos produce la mayor eficiencia de transformación para E. coli competente NEB 10-beta (NEB n.° C3019H y NEB n.° C3019I). Se espera una pérdida de aproximadamente el 40 % de la eficiencia de transformación al aplicar el choque térmico durante 80 segundos (véase la figura en la página principal del producto). P: ¿Cuánto tiempo debo incubar las células en hielo después de añadir el ADN (NEB n.° C3019H)? ¿Y NEB n.° C3019I? R: Se recomienda incubar el ADN con células competentes NEB 10-beta en hielo durante 30 minutos. Se espera una pérdida de aproximadamente el 50 % en la eficiencia de transformación al incubar durante 10 minutos (consulte la figura en la página principal del producto). P: ¿Qué tipo de tubos de transformación se deben utilizar? R: En comparación con el tubo de 2,0 ml que se incluye con las células competentes de formato desechable NEB, el tubo Eppendorf de 1,5 ml que probamos funcionó correctamente. P: ¿Qué volumen de ADN se puede añadir a las células competentes? R: El volumen de ADN que se añade a las células competentes afecta la eficiencia de transformación. Se recomiendan de 1 a 5 µl de ADN (plásmido o producto de ligación) por cada 50 µl de células competentes. En 50 µl de células competentes, la eficiencia de transformación disminuye al 52 % cuando el volumen de ADN se aumenta a 10 µl (de 2 µl). La eficiencia de transformación disminuye al 18 % cuando el volumen de ADN se aumenta a 20 µl. (a partir de 2 µl). La eficiencia de transformación disminuye al 5,2 % cuando el volumen de ADN aumenta a 50 µl (a partir de 2 µl). P: ¿Son las células competentes de NEB compatibles con el protocolo "Mix & Go"? R: Existe un protocolo "Mix & Go" que proporciona una forma rápida de transformar las células simplemente añadiendo plásmido a las células y sembrando. No se requiere choque térmico. NEB ha probado nuestras células competentes en este protocolo frente al producto "Mix & Go" de otra empresa. Hemos observado que ambos producen un número similar de colonias; sin embargo, las colonias de NEB son de mayor tamaño con el mismo período de incubación. P: ¿Qué tipo de células competentes son adecuadas para la transformación de construcciones de ADN creadas con NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix? R: Las construcciones de ADN resultantes son compatibles con la mayoría de las células competentes de E. coli. NEB recomienda utilizar NEB 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency, NEB #C2987). Si los productos ensamblados superan los 15 kb, NEB recomienda usar NEB 10-beta E. coli competente (alta eficiencia, NEB n.° C3019) o NEB 10-beta E. coli electrocompetente (NEB n.° C3020). Si los genes ensamblados contienen secuencias repetitivas, se debe usar NEB Stable Competent E. coli (NEB n.° C3040). ¿No está seguro de qué cepa de clonación elegir? El muestreador NEB Cloning Competent E. coli (NEB n.° C1010) le permite muestrear 4 de nuestras populares cepas químicamente competentes. P: ¿Por qué el biólogo sintético Chris Voigt del MIT eligió NEB 10-beta para el ensamblaje y la clonación de ADN? R: ¿Puede una célula viva realizar cálculos? Al codificar circuitos en el ADN y transformarlos en un huésped bacteriano vivo, los organismos pueden manipularse para procesar señales ambientales y modificar su función biológica. Esta reutilización de la función biológica es la piedra angular de la biología sintética y está transformando mercados como el de los biocombustibles y el de la alimentación. industria mediante la ingeniería de nuevos organismos diseñados para la fabricación o la detección biológica. Lograr esto requiere un ensamblaje confiable de grandes construcciones de ADN con disposiciones específicas de partes de ADN y un organismo bien caracterizado en el que colocarlas. El diseño de grandes construcciones de ADN es complejo y el ensamblaje puede ser un desafío formidable. Chris Voigt, biólogo sintético del Broad Institute, y su equipo desarrollaron un entorno computacional (Cello) para estandarizar el diseño de estos ensamblajes basándose en parámetros y restricciones proporcionados por el usuario. Como señalan Voigt y su equipo, el comportamiento de los circuitos genéticos depende de muchas partes cuya función puede variar según el contexto genético, la cepa y las condiciones de crecimiento. A la hora de seleccionar una cepa celular competente, eligieron NEB 10-beta. E. coli competente. ¿Por qué se eligió NEB 10-beta para Cello? Recombinación reducida por la mutación RecA1. Capacidad para clonar y propagar plásmidos grandes. Alta eficiencia de transformación. Mejor crecimiento en M9 + glucosa que algunas otras cepas. Resistente al fago T1. Genotipo definido. Ya se utiliza en Muchos laboratorios en todo el mundo. P: ¿Cómo debo almacenar el medio de crecimiento estable NEB 10-beta? R: El medio de crecimiento estable NEB 10-beta se puede almacenar a 4 °C o a temperatura ambiente, dependiendo de la rapidez con la que se vaya a utilizar. El almacenamiento a temperatura ambiente es conveniente y adecuado para usos a corto plazo (de semanas a un par de meses). Para el almacenamiento a largo plazo, recomendamos almacenarlo a 4 °C. P: ¿Cómo se deben preparar los fragmentos para el ensamblaje con NEBuilder HiFi? R: Los fragmentos se pueden preparar mediante los siguientes métodos: Los fragmentos generados por PCR se pueden limpiar utilizando la columna de PCR Monarch o el kit de limpieza rápida de PCR Exo-CIP si la pureza del amplicón es superior al 95 %. Si se utilizó ADN plasmídico como plantilla durante la PCR, se puede eliminar mediante tratamiento con DpnI si es necesario. Si se observan múltiples bandas, recomendamos optimizar la PCR. Si esto no es posible, se recomienda la purificación en gel. La extracción en gel puede introducir tiocianato de guanidina (de la disolución). (tampón) que puede reducir la eficiencia de la reacción de ensamblaje. Para minimizar esta contaminación, recorte el corte de gel para poder usar una menor cantidad de tampón de disolución de gel. La digestión con enzimas de restricción de un plásmido puede realizarse seguida de inactivación por calor o purificación en columna. Los fragmentos comerciales pueden resuspenderse en agua sin nucleasas o tampón TE y usarse directamente en la reacción de ensamblaje. P: ¿Se puede separar en secciones más pequeñas la placa de 96 pocillos de E. coli competente NEB 10-beta, NEB n.° C3019P? R: Sí. Para la placa de 96 pocillos, las células de E. coli competente NEB 10-beta se empaquetan en una placa de polipropileno divisible de 96 pocillos y se sellan con una película de aluminio. La placa se puede dividir en cuatro segmentos separados de 24 pocillos al realizar transformaciones a menor escala. Para separar un segmento de 24 pocillos, coloque la placa de 96 pocillos en hielo seco, doble la placa por las conexiones y corte el sello de aluminio entre ellas. Las secciones. Las secciones no utilizadas deben devolverse al congelador a -80 °C para su almacenamiento. P: ¿Cómo se compara la eficiencia de transformación del formato de placa de 96 pocillos (NEB n.° C3019P) con la de los otros formatos? R: La eficiencia de transformación (ET) del formato de placa de 96 pocillos NEB 10-beta Competent E. coli (NEB n.° C3019P) es menor que la de los otros dos formatos, NEB n.° C3019H y NEB n.° C3019I. La ET de C3019P es de 1-3 x 108 ufc/μg de pUC19.